五倍子及其有效成分沒食子酸在中華倒刺鲃和南方鲇的藥理學(xué)研究.pdf

1、中藥及其有效成分在水產(chǎn)動物的疾病防治等方面顯示出明顯的作用與效益，越來越受到水產(chǎn)工作者的重視，逐漸成為水產(chǎn)藥物研究的熱點。它們以取自天然、毒副作用小、無藥物殘留和抗藥性、對健康無害、高效安全等優(yōu)點，不但可以解決抗生素等化學(xué)合成藥物引發(fā)的病原菌抗藥性、殘留超標(biāo)、養(yǎng)殖環(huán)境污染、微生態(tài)平衡的破壞等問題，同時滿足人們對食品安全和環(huán)境安全的需求，完全符合目前發(fā)展無公害水產(chǎn)養(yǎng)殖和生產(chǎn)綠色水產(chǎn)品的疾病防治原則，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會效益。五倍子（Gal

2、la chinensis，GC）是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖常用的中藥，具有顯著的抑菌殺菌作用，主要用于防治水產(chǎn)動物的水霉病、白頭白嘴病、赤皮病、氣單胞菌病、假單胞菌病、粘細(xì)菌病、白皮病以及癤瘡病等疾病。沒食子酸（Gallic acid，GA）是五倍子的主要有效成分之一，具有較為肯定的抗氧化、抗病毒、抑菌等多種生物學(xué)活性，也常被用作飼料添加劑。本論文根據(jù)五倍子及沒食子酸的作用和結(jié)構(gòu)特點，以兩種生活習(xí)性和食性完全不同的名特優(yōu)養(yǎng)殖魚類—中華倒刺鲃（Spi

3、nibarbus sinensis）和南方鲇（Silurus meridionalis）為對象，分別用在體和離體的方法開展了它們對兩種魚的藥理學(xué)研究。具體研究結(jié)果如下：
　?。?）在（25±0.5）℃水溫條件下以GC的有效成分GA20 mg/kg魚體質(zhì)量單劑量口灌GC醇提液后，以GA為目標(biāo)藥物研究GC在中華倒刺鲃體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)特征。藥物濃度采用反相高效液相色譜法檢測，流動相為甲醇：水：磷酸=20:76:4（v/v/v），流速

4、為0.8 ml/min，檢測波長為273 nm，此條件下GA的平均回收率為92％-115%，日內(nèi)精密度和日間精密度范圍為0.2-6.71，符合藥動學(xué)方法學(xué)的要求。藥動學(xué)數(shù)據(jù)用房室模型和非房室模型法同時分析，血液中的藥動學(xué)數(shù)據(jù)可以用一級吸收二室開放模型描述，藥物在中華倒刺鲃體內(nèi)血液、肝臟和腎臟均在1 h時達(dá)到最大藥物峰，最大藥物濃度（Cmax）值分別是：9.1656，76.2143和85.8602μg/ml或μg/g，其吸收、分布和消除半

5、衰期分別是：0.523，1.054和10.501 h，藥時曲線下面積（AUC）分別是77.3967，402.1059和258.0476μgh/ml或者μgh/g；平均駐留時間（MRT）分別是19.3091，25.935和6.4803 h。
　?。?）在（25±0.5） ℃水溫條件下以GC的有效成分GA20 mg/kg魚體質(zhì)量單劑量口灌GC醇提液后，考察中華倒刺鲃體內(nèi)的各生理生化指標(biāo)的變化情況。取樣時間分別是給藥后1h、12 h、2

6、4 h和48 h，分別稱為1 h組、12 h組、24 h組和48 h組，另取未給藥實驗魚為對照（稱為對照組），其紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白質(zhì)量濃度和紅細(xì)胞壓積等血液生理指標(biāo)，鈉（Na+）、鉀（K+）、鈣（Ca2+）、鎂（Mg2+）、氯（Cl-）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、血糖（GLU）、總蛋白（TP）、球蛋白（GLB）、白蛋白（ALB）、尿素（UREA）、尿

7、酸（UA）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（AKP）等血液生化指標(biāo)的變化情況。隨著給藥后時間的延長，生理指標(biāo)方面：紅細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白質(zhì)量濃度降低，白細(xì)胞數(shù)升高；生化指標(biāo)方面：血糖、尿酸、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶均先升后降，蛋白質(zhì)(包括總蛋白和球蛋白)和甘油三酯水平略降，其他生化指標(biāo)相對變化不具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　?。?）（27±0.5）oC時用南方鲇亞成體血液制備1%紅細(xì)胞懸液，體外研究0，5，10

8、，20，40和80 mg/L GA在不同時間對南方鲇紅細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)和表面形貌的影響，檢測氧化指標(biāo)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽酶（GPx）和戊二醛（MDA，脂類過氧化產(chǎn)物）且觀察紅細(xì)胞相應(yīng)的溶血和表面形貌的變化，同時還檢測了諾氟沙星（Norfloxacin。NFLX）相應(yīng)指標(biāo)以做對比，并以此對兩種藥物進(jìn)行藥物評價。實驗分為兩部分，第一部分研究了GA對南方鲇紅細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)和表面形貌的影響與藥物作用的時間和濃度

9、的關(guān)系。結(jié)果顯示：GA在0-80 mg/L濃度范圍內(nèi)，與4 h組相比，同一濃度24 h組的溶血OD值變大。SOD，CAT和GPx等抗氧化酶略有降低，MDA值略有增大；而除4 h組溶血不具有統(tǒng)計學(xué)意義差異，24 h組溶血OD先降后升外，無論是4 h組還是24 h組三種抗氧化酶均先升高再降低的趨勢，MDA先下降再升高的趨勢，且24 h濃度組的變化趨勢更明顯，反映在表面形貌上4 h組除80 mg/L濃度組可以看到少數(shù)紅細(xì)胞表面略有皺縮變形，其

10、它組與對照組無顯著差異。24 h組5，10，20 mg/L濃度組與對照組相比紅細(xì)胞均無顯著變化，40和80 mg/L濃度組紅細(xì)胞表面損傷逐漸明顯。第二部分選擇GA和NFLX對紅細(xì)胞溶血均沒有顯著差異的4 h時進(jìn)行兩種藥物對南方鲇紅細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)和表面形貌影響的對比實驗。結(jié)果顯示：NFLX對南方鲇紅細(xì)胞的影響，與對照組相比，SOD和GPx活性5 mg/L時不具有統(tǒng)計學(xué)意義差異，20-80 mg/L時顯著降低（p<0.05）；CAT活性5和

11、20 mg/L時顯著升高，40 mg/L時CAT不具有統(tǒng)計學(xué)意義變化，80 mg/L顯著降低（p<0.05）。MDA水平除5 mg/L與對照組無差異，其它隨著濃度的增加逐漸增大（p<0.05）。除5 mg/L時沒有明顯損傷外，隨著濃度增大，紅細(xì)胞表面開始皺縮，邊緣開始有缺口，80 mg/L時損傷最為嚴(yán)重。
　?。?）（27±0.5） ℃時用200μmol/l過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)南方鲇幼魚紅細(xì)胞的過氧化損傷模型來進(jìn)一步探討GA的

12、保護(hù)作用機(jī)制。根據(jù)溶血實驗的結(jié)果選擇10，25和50 mg/L GA濃度孵育24 h來研究GA對H2O2誘導(dǎo)的南方鲇紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。以不加H2O2和GA的溶液為空白組，只加H2O2不加GA液為對照組，各GA濃度組的活性氧（ROS）均有所下降，25 mg/L時ROS為最低；各濃度的SOD、CAT和GPx活性比對照組有顯著升高（p<0.05），各給藥組SOD活性與空白組之間不具有統(tǒng)計學(xué)意義差異；10 mg/L濃度組CAT活性與空白

13、組不具有統(tǒng)計學(xué)意義差異，25和50 mg/L濃度組CAT活性顯著大于空白組；25 mg/L濃度組GPx活性顯著大于其它各濃度組和空白組（p<0.05）。對照組MDA含量比其它各組顯著增大（p<0.05），10 mg/L濃度組與空白組不具有統(tǒng)計學(xué)意義差異，25和50 mg/L組比空白組顯著變小（p<0.05）。就DNA水平而言，只有在對照組中才有中度損傷和重度損傷的細(xì)胞存在，其它各組細(xì)胞均屬無損傷細(xì)胞和輕度損傷細(xì)胞，10-50 mg/L濃

14、度組的無損傷細(xì)胞高于空白組，更高于對照組，且10-50 mg/L濃度組的OTM明顯的要小于對照組和空白組。
　　主要研究結(jié)論：
　　（1）單次口灌GC醇提液在中華倒刺鲃體內(nèi)吸收迅速，分布廣泛，在血液、肝臟和腎臟中濃度較高，能很好的發(fā)揮藥效，并且藥物在體內(nèi)消除很快，不會在體內(nèi)蓄積造成不良影響。
　?。?）單次口灌GC醇提液對中華倒刺鲃幼魚血液生理生化指標(biāo)有一定的影響，隨著藥物的代謝，體內(nèi)藥物質(zhì)量濃度逐漸降低，影響亦逐漸消

15、除。也可因此說單次給藥劑量不能過大。
　　（3）一定濃度范圍內(nèi)（0-80 mg/L），GA對健康南方鲇紅細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)和表面形貌的影響是雙向的，與濃度和作用時間相關(guān)。也就是說GA既有抗氧化性又有促氧化性。同樣溫度、濃度范圍內(nèi)NFLX對健康南方鲇紅細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)和表面形貌沒有明顯的抗氧化性。
　?。?）引入了紅細(xì)胞氧化損傷的概念進(jìn)行藥物評價。根據(jù)紅細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)和表面形貌的變化可進(jìn)行藥物評價。依據(jù) GA和 NFLX的抗氧化

16、對比實驗并結(jié)合之前兩種藥物對水產(chǎn)動物的藥動學(xué)和藥效學(xué)特點的研究，推薦GA在合適的給藥劑量是一種更為安全有效的水產(chǎn)動物藥物。
　?。?）魚病被發(fā)現(xiàn)時往往已經(jīng)非常嚴(yán)重難以救治，本實驗中藥物作用4 h時紅細(xì)胞溶血尚未有顯著，但是其抗氧化指標(biāo)和表面形貌已有一定的變化趨勢，因此紅細(xì)胞氧化損傷概念的引入還有利于魚病的提前檢出。
　?。?）GA對低濃度 H2O2誘導(dǎo)南方鲇紅細(xì)胞的過氧化損傷有保護(hù)作用，可以從活性氧（ROS）、抗氧化酶、脂類