犬臍血間質(zhì)干細胞肌源性誘導(dǎo)及梗塞心肌移植后影響心功能機制的研究.pdf

1、目的： 研究犬臍血間質(zhì)干細胞肌源性誘導(dǎo)后生理性質(zhì)的變化以及移植后對心臟功能影響機制。 方法： 選取孕齡50天左右的妊娠犬，取臍帶血，密度梯度離心法分離單個核細胞，應(yīng)用DMEM液培養(yǎng)擴增干細胞，免疫組化法檢測細胞表面抗原CD34、CD11a、CD11b、CD29、CD71的表達，確認間質(zhì)干細胞。選取第四代的間質(zhì)干細胞，經(jīng)5-aza、心肌裂解液和心肌誘導(dǎo)液三種方法肌源性誘導(dǎo)分化，檢測Nkx2.5基因的表達，免疫組化染

2、色檢測a-actin、desmin、β-MHC、troponin-Ⅰ的陽性率；膜片鉗全細胞模式檢測4組細胞的動作電位發(fā)放情況，比較外向鉀電流的差異；confocal檢測細胞內(nèi)Ca2+的濃度變化和KCL對胞內(nèi)Ca2+濃度的影響。rAAV1/2-LacZ轉(zhuǎn)染間質(zhì)干細胞，采用X-gal化學(xué)染色法檢測標記基因產(chǎn)物β-gal。成年犬36條，隨機分為實驗組與對照組。結(jié)扎冠狀動脈左前降支建立急性心肌梗塞動物模型。實驗組經(jīng)冠狀動脈左前降支將5-aza誘

3、導(dǎo)的間質(zhì)干細胞注射移植入梗塞區(qū)域，對照組僅經(jīng)冠狀動脈左前降支注射等量的DMEM培養(yǎng)液。分別于術(shù)后2、4、8周在DSA下行左心室造影測定心功能，然后處死動物，取心肌組織免疫熒光法檢測移植細胞β-gal和細胞間連接蛋白表達，以觀察移植間質(zhì)干細胞的存活、心肌再生和細胞間連接的形成。TUNEL法檢測殘存心肌細胞的凋亡，免疫組化染色法測定梗塞區(qū)域心肌細胞Bcl-2和Bax蛋白的表達，探討干細胞移植對心肌細胞凋亡的影響；檢測殘存心肌體積和心肌膠原網(wǎng)

4、沉積，探討干細胞移植對殘存心肌的影響。應(yīng)用Image-ProPlus5.1軟件進行圖像分析，計算光密度(density)值和累積光密度(IOD)值。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±sd)表示，3組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)和卡方檢驗，P＜0.05認為有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行t檢驗統(tǒng)計學(xué)處理。 結(jié)果： 所培養(yǎng)的細胞呈現(xiàn)長梭形，表面抗原表達為：CD11a(-)、CD11b(-)、CD34(-)、C

5、D29(+)、CD71(+)，提示為臍血間質(zhì)干細胞。3種誘導(dǎo)方法均可誘導(dǎo)Nkx2.5的表達，細胞裂解液組表達量最高。MSCs在分化前不表達心肌結(jié)構(gòu)蛋白，誘導(dǎo)后可表達α-actin、desmin、β-MHC和Troponin-I，四種蛋白在不同的分化條件下表達的陽性率不同；MSCs和細胞誘導(dǎo)液組未見明顯動作電位產(chǎn)生，心肌裂解液組和5-aza組可產(chǎn)生動作電位；受誘導(dǎo)方法影響，4種細胞的鉀電流、細胞內(nèi)Ca2+的濃度和KCL對胞內(nèi)Ca2+濃度的

6、影響也有所變化。rAAV1/2-LacZ可高效轉(zhuǎn)染臍血間質(zhì)干細胞，并能長期表達標記基因LacZ的產(chǎn)物β-gal。5-aza誘導(dǎo)后并經(jīng)LacZ報告基因標記的間質(zhì)干細胞經(jīng)冠狀動脈移植入急性心梗心臟的梗塞區(qū)域，移植的細胞在梗塞周邊區(qū)存活并與殘存心肌通過connexin-43和cadherin形成細胞間連接。術(shù)后2、4、8周左心室造影測定心功能顯示：實驗組的EF值明顯高于對照組，而INEDVI明顯低于對照組。實驗組的心肌細胞凋亡指數(shù)低于對照組，

7、Bcl-2蛋白表達量明顯高于對照組，而Bax蛋白表達量低于對照組。實驗組殘存心肌體積高于對照組，膠原網(wǎng)排列有序。 結(jié)論： 1、臍血間質(zhì)干細胞可被誘導(dǎo)為肌源性細胞；三種誘導(dǎo)方法對心肌結(jié)構(gòu)蛋白、電生理和胞內(nèi)Ca2+濃度調(diào)控系統(tǒng)的分化程度不一樣，單一的誘導(dǎo)方法尚難以在體外誘導(dǎo)出成熟的心肌細胞，綜合考慮三方面性質(zhì)，5-aza誘導(dǎo)的心肌樣細胞與心肌細胞最為接近。 2、臍血間質(zhì)干細胞肌源性誘導(dǎo)后移植可以： a、心肌再

8、生。體外誘導(dǎo)后的間質(zhì)干細胞具有肌源性細胞的初步性質(zhì)，進入心肌微環(huán)境后進一步分化成熟，形成閏盤結(jié)構(gòu)，與宿主心肌形成細胞間連接； b、通過上調(diào)Bcl-2、減少Bax的表達而拮抗心肌凋亡，減少心梗后心肌細胞的進一步丟失； c、短期內(nèi)促進殘存心肌肥大，增加心肌收縮力； d、降低或防止心肌梗塞區(qū)域內(nèi)膠原纖維的沉積和融合，使心肌膠原網(wǎng)有序排列，從而降低心室舒張僵硬度，改善心室重構(gòu)。 3、臍血間質(zhì)干細胞梗塞心肌移植后可