TIMP-2、MT1-MMP、MMP-2的表達(dá)對(duì)人類(lèi)單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系SHI-1細(xì)胞侵襲力影響的研究.pdf

1、目的和意義：
　　 急性白血病常伴有髓外浸潤(rùn)(EMI)的發(fā)生，急性髓細(xì)胞白血病(AML)中EMI的發(fā)生率約為20％-40％，并且多見(jiàn)于FAB分型中的M4、M5亞型。伴有EMI的患者大多數(shù)誘導(dǎo)化療后的緩解率低，總體生存時(shí)間短，預(yù)后差。闡明白血病髓外浸潤(rùn)的病理發(fā)生過(guò)程及機(jī)制，有助于預(yù)防白血病的復(fù)發(fā)，改善白血病的預(yù)后。研究表明AML的EMI如同腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移一樣，需要白血病細(xì)胞克服ECM屏障。已有研究報(bào)道急性白血病患者高表達(dá)基質(zhì)金屬

2、蛋白酶(MMPs)，并且提示這些高表達(dá)可能與EMI的特性有關(guān)，但是MMPs及其抑制劑在AML的EMI中確切作用和機(jī)制仍不清楚。SHI-1細(xì)胞是本研究所建立的一株具有高浸潤(rùn)特性的人類(lèi)急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系。本實(shí)驗(yàn)室前期研究中已用SHI-1細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)建立了白血病多臟器浸潤(rùn)的動(dòng)物模型，并報(bào)道上調(diào)組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑2(TIMP-2)促進(jìn)了SHI-1細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的浸潤(rùn)。在此基礎(chǔ)上，本課題將研究TIMP-2、I型膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(

3、MTl-MMP)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)的表達(dá)對(duì)SHI-1細(xì)胞體內(nèi)外侵襲力的影響，探索白血病髓外浸潤(rùn)的機(jī)制。
　　 方法：
　　 第一部分體外培養(yǎng)SHI-1、NB4、K562、U937、THP-1細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)。定量PCR檢測(cè)五株細(xì)胞的TIMP-2、MTl-MMP、MMP-2的mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。RNA干擾分別沉默SHI-1細(xì)胞的TIMP-2、MTl-MM

4、P、MMP-2。構(gòu)建TIMP-2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，轉(zhuǎn)染SHI-1細(xì)胞，G418篩選出多克隆細(xì)胞，RT-PCR鑒定有外源性TIMP-2基因整合后，經(jīng)有限稀釋法挑選出單克隆細(xì)胞S1、S2、S3。PCR鑒定單克隆細(xì)胞的外源性TIMP-2基因整合。定量RT-PCR檢測(cè)單克隆細(xì)胞TIMP02、MTl-MMP、MMP-2的mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。明膠酶譜法測(cè)定五種細(xì)胞株、單克隆細(xì)胞、干擾后的細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)或和BMSC

5、s共培養(yǎng)24小時(shí)后上清中MMP-2酶原(proMMP-2)分泌和活化的MMP-2的表達(dá)。收集BMSCs單獨(dú)無(wú)血清培養(yǎng)24h、48h、72h后的上清檢測(cè)proMMP-2的分泌和活化的MMP-2?？缒で忠u實(shí)驗(yàn)觀察各種細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)或和BMSC共培養(yǎng)24小時(shí)后侵襲人工基質(zhì)膜的能力。
　　 第二部分對(duì)4周齡的BALB/c裸鼠進(jìn)行脾臟切除(splenectomy)、環(huán)磷酰胺腹腔注射(cytoxan intraperitoneal injec

6、tion)及全身亞致死劑量輻照(sublethal irradiation)等預(yù)處理(SCI預(yù)處理)后隨機(jī)分為：空白對(duì)照組(n=5)、實(shí)驗(yàn)組(SHI-1組、MOCK組、S1組、S2組、S3組，每組n=15)。經(jīng)尾靜脈接種lxl0?含不同細(xì)胞的IMDM液0.2ml/只后，在層流柜中無(wú)菌飼養(yǎng)觀察至注射后60天。于裸鼠瀕死前或死亡后即行解剖，留取骨髓涂片，瑞氏染色觀察有無(wú)異常的白血病細(xì)胞；各臟器常規(guī)病理切片，觀察異常白血病細(xì)胞在各臟器中的浸潤(rùn)

7、情況；RT-PCR檢測(cè)裸鼠各臟器中人白血病細(xì)胞MLL/AF6融合基因的表達(dá)。流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)裸鼠股骨骨髓中人CD45陽(yáng)性細(xì)胞比例。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分 SHI-1細(xì)胞株的TIMP-2、MTl-MMP、MMP-2的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均高于其它細(xì)胞株(P<.05)。SHI-1細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)以及和BMSC共培養(yǎng)24h后上清中的proMMP-2(72KDa)和活化的MMP-2(62KDa)含量及體外侵襲率均

8、高于其它細(xì)胞株(P<.05)。并且共培養(yǎng)24h后proMMP-2的分泌、MMP-2的活化和體外侵襲率均高于單獨(dú)培養(yǎng)的(P<.05)。BMSC單獨(dú)培養(yǎng)24h后的上清中檢測(cè)不到proMMP-2的分泌和MMP-2的活化，直到48h才能檢測(cè)到，72h后達(dá)高峰。RNA干擾沉默TIMP-2、MTl-MMP、MMP-2基因的效率為85％-98％。基因沉默SHI-1細(xì)胞TIMP-2、MMP-2、MTl-MMP后，細(xì)胞侵襲率均分別下降60％-70％、50

9、％-60％、40％-50％(P<.05)。干擾后的條件培養(yǎng)基中檢測(cè)不到活化的MMP-2片段。RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染了TIMP-2 cDNA的多克隆細(xì)胞和單克隆細(xì)胞均有外源性TIMP-2基因的整合和表達(dá)。單克隆細(xì)胞S1、S2、S3 TIMP-2的mRNA表達(dá)水平分別是SHI-1細(xì)胞的3.2倍、2.2倍、1.7倍(P<.05)，蛋白表達(dá)水平分別上調(diào)2.6倍、1.9倍、1.5倍(P<.01)，體外侵襲率增加了1.5倍-2.5倍(P<.05)，活

10、化的MMP-2增加了1.5倍-3倍(P<.01)。單克隆細(xì)胞的MTl-MMP、MMP-2的表達(dá)和條件培養(yǎng)基中的proMMP-2表達(dá)和SHI-1細(xì)胞沒(méi)有差異。
　　 第二部分對(duì)照組裸鼠注射后1-2周進(jìn)食減少、體重下降、消瘦，2周后逐漸恢復(fù)正常，生存期大于60天以上而無(wú)死亡。SHI-1組和MOCK組裸鼠尾靜脈注射細(xì)胞后，同樣1-2周進(jìn)食減少、體重下降、消瘦，2周后漸漸恢復(fù)，但5-6周左右再次出現(xiàn)進(jìn)食減少，體重下降，部分裸鼠出現(xiàn)雙下肢

11、的癱瘓，眼、頭顱等部位腫塊生長(zhǎng)，并逐漸衰竭死亡。SHI-1組中位生存期45天(40-48天)，MOCK組中位生存期44天(39-49天)。S1、S2和S3細(xì)胞注射組裸鼠發(fā)病時(shí)間較SHI-1組提前，注射細(xì)胞后4-5周即再次出現(xiàn)進(jìn)食減少，體重下降，部分裸鼠雙下肢癱瘓，眼、頭顱等部位腫塊生長(zhǎng)，并逐漸衰竭死亡。中位生存期S1組35天(33-38天)、S2組38天(35-42天)、S3組39天(37-43天)。MOCK組裸鼠生存期與SHI-1組無(wú)

12、差別，S1、S2和S3細(xì)胞注射組裸鼠較SHI-1組生存期縮短(P<.05)。對(duì)照組裸鼠的各臟器組織無(wú)異常病理改變，實(shí)驗(yàn)組各組胃、肝臟、肺、腎臟、腦等多臟器組織均出現(xiàn)明顯的白血病細(xì)胞浸潤(rùn)。S1、S2和S3細(xì)胞注射組裸鼠骨髓淙片中人白血病細(xì)胞的比例大于SHI-1組(P<.05)。除空白對(duì)照組外，各組裸鼠體內(nèi)形成的腫塊、肝臟、腎臟、肺、睪丸、心臟、胃、腦、腸以及骨髓中均擴(kuò)增出MLL/AF6融合基因，并且SI、S2和S3組裸鼠臟器累及多于SHI

13、-1組和MOCK組(P<.05)?？瞻讓?duì)照組裸鼠骨髓中未檢測(cè)到人CD45陽(yáng)性細(xì)胞，S1、S2和S3細(xì)胞注射組裸鼠中人CD45陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)高于SHI-1組和MOCK組(P<.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)本研究發(fā)現(xiàn)SHI-1細(xì)胞在mRNA水平和蛋白水平均高表達(dá)TIMP-2、MTl-MMP, MMP-2.
　　 (2)TIMP-2、MTl-MMP、MMP-2這些分子的高表達(dá)通過(guò)促進(jìn)MMP-2的活化，增強(qiáng)了SH

14、I-1細(xì)胞的體外侵襲力。
　　 (3)骨髓基質(zhì)細(xì)胞和SHI-1細(xì)胞共培養(yǎng)增強(qiáng)了細(xì)胞的體外侵襲力。
　　 (4)內(nèi)源性上調(diào)1.5倍-2.5倍的TIMP-2不但增強(qiáng)了SHI-1細(xì)胞的體外侵襲力，而且使SHI-1細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)形成了更為廣泛和嚴(yán)重的白血病浸潤(rùn)，從而導(dǎo)致裸鼠白血病的發(fā)病時(shí)間提前，生存期縮短。因此上調(diào)TIMP-2對(duì)SHI-1細(xì)胞的體內(nèi)外侵襲力發(fā)揮的均是增強(qiáng)作用，而不是抑制作用。
　　 綜上所述：本研究表明S

15、HI-1細(xì)胞在mRNA和蛋白水平結(jié)構(gòu)性高表達(dá)MMP-2、MTl-MMP、TIMP-2。上調(diào)1.5倍-2.5倍TIMP-2不但和高表達(dá)TIMP-2、MMP-2、MTl-MMP一樣在骨髓基質(zhì)細(xì)胞存在的條件下通過(guò)促進(jìn)MMP-2的活化增強(qiáng)了細(xì)胞的體外侵襲力，而且增強(qiáng)了SHI-1細(xì)胞的體內(nèi)侵襲力，在裸鼠體內(nèi)形成了更為廣泛和嚴(yán)重的白血病浸潤(rùn)。本研究結(jié)果提示對(duì)伴有EMI的AML患者，尤其是高表達(dá)MMP-2和MTl-MMP的，增加TIMP-2反而導(dǎo)致負(fù)