聯(lián)合基因（CD和TNF-α）治療喉癌的實驗研究.pdf

1、喉癌是最常見的頭頸惡性腫瘤之一，全球每年約有190，000例新增喉癌病例，并且其發(fā)病率有增高趨勢。晚期喉癌經(jīng)手術或術后輔以放療或化療的5年生存率不足60％，術后造成喉功能全部或部分喪失，生活質量明顯下降，嚴重的威脅著人類的生命和健康。 基因治療是治療惡性腫瘤的最具有潛力的新方法，由于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移是多因素及多階段的復雜過程，聯(lián)合基因治療可從多個環(huán)節(jié)控制腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，提高基因治療的腫瘤抑制率和抗腫瘤免疫效應，降低其毒副

2、作用。目前國內(nèi)外學者進行的有關聯(lián)合基因抑制腫瘤的實驗，均存在聯(lián)合基因構建操作復雜，容易突變，腫瘤抑制效果不理想，選擇的基因治療窗小等不足，同時未見有胞嘧啶脫氨酶(eytosinedeaminase，CD)基因聯(lián)合腫瘤壞死因子-α(toumornecrosisfactor-α，TNF—α)基因治療喉癌的實驗研究。 自殺基因前體藥物系統(tǒng)CD/5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC)將無毒性前藥5-Fc轉化為細胞毒產(chǎn)

3、物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)，從而阻止DNA合成，使靶細胞走向死亡。TNF—α能充分調動機體的抗腫瘤免疫反應，對腫瘤有直接殺傷作用，損傷腫瘤組織微血管。兩種基因的腫瘤抑制機制不同，而且有協(xié)同作用，因而可以從多個環(huán)節(jié)抑制腫瘤生長，達到優(yōu)勢互補，提高腫瘤抑制率及抗腫瘤免疫反應的目的。 質粒載體pcDNA3.1(+)跟常用的病毒載體比較，具有無免疫原性、安全、能穩(wěn)定遺傳等特點。另外pcDNA3.1(+)中C

4、MV啟動子來源于巨細胞病毒，是可以啟動外源性基因表達的強啟動子；并且本研究所插入的目的基因CD和TNF-α片段小，僅有1284bp和687bp，操作簡單。 本研究通過構建自殺基因CD聯(lián)合細胞因子TNF—α基因共表達的非病毒載體并導入喉癌Hep-2細胞，觀察CD基因和TNF—α基因共表達產(chǎn)物在5-FC作用下于體內(nèi)外對喉癌細胞系Hep-2的殺傷作用并研究其作用機制。 研究方法： 1.構建目的基因真核表達載體pcDNA

5、3.1(+)/TNF-α-IRES—CD、pcDNA3.1(+)/CD、pcDNA3.1(+)/TNF—α，并用酶切、PCR和DNA測序進行鑒定。 2.將以上各目的基因真核表達載體及pcDNA3.0(+)空白質粒在Lipofectamine2000介導下分別轉染喉癌細胞Hep-2，G418篩選出抗性克隆并擴大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定表達株，分別命名為Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/TNF-α、Hep-2/0，RT—PCR

6、檢測各目的基因的表達。 3.MTT法檢測體外細胞殺傷作用。 4.MTT法檢測旁觀者效應。 5.流式細胞儀檢測細胞凋亡率。 6.用BALB/c裸鼠構建Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/TNF—α、Hep-2/0四組人喉鱗癌裸鼠皮下移植瘤模型。細胞接種的第8天(移植瘤直徑約5mm)開始，每天腹腔給予5-FC，連續(xù)12天。比較給藥前后腫瘤體積變化、腫瘤倍增時間及抑瘤率，通過病理切片觀察組織病理變

7、化。 7.統(tǒng)計學方法：采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(-X±S)表示，用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結果： 1.目的基因真核表達載體的構建及細胞轉染1.1目的基因真核表達載體pcDNA3.1(+)/CD、pcDNA3.1(+)/TNF—α、pcDNA3.1(+)-TNF—α—IRES—CD構建成功，經(jīng)酶切、PCR和DNA測序證實各插入基因及聯(lián)合基因的大小、位置、方向均正確

8、無誤。 1.2RT—PCR證明各重組外源基因在已轉染目的基因真核表達載體的喉癌細胞系Hep-2中均有表達。 2.體外實驗 2.1體外細胞殺傷實驗Hep-2/TIC組的細胞殺傷作用最強，其殺傷作用呈濃度依賴性，與Hep-2/CD、Hep-2/TNF-α、Hep-2/0組的差異均有顯著性(P<0.05)。 2.2體外旁觀者效應Hep-2/TIC，Hep-2/CD組細胞均顯示出明顯的旁觀者效應，其中以Hep-2

9、/TIC組最明顯，兩組間的差異有顯著性(P<0.05)。而Hep-2/TNF—a和Hep-2/0組細胞未顯示出旁觀者效應。 2.3細胞凋亡檢測Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/TNF—α、Hep-2/0四組細胞中以Hep-2/TIC組的凋亡率最高，四組兩兩之間比較差異均有顯著性(P<0.05)。 3.體內(nèi)實驗 3.1人喉鱗癌裸鼠皮下移植瘤模型的構建經(jīng)典的皮下種植方法成功構建人喉鱗癌裸鼠皮下移植瘤模

10、型，細胞注射數(shù)量為5×106，成瘤率83％，成瘤時間6—8天。 3.2體內(nèi)實驗抑瘤作用Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/TNF—α、Hep-2/0四組裸鼠中，Hep-2/TIC組裸鼠移植瘤的倍增時間最長、生長速度最慢、治療后移植瘤平均體積最小，抑瘤率達97.40％，其中有一只裸鼠移植瘤完全消除。 3.3移植瘤的組織病理學3.3.1HeF-2/TIC組：移植瘤內(nèi)見大量腫瘤組織壞死，有較多淋巴細胞浸潤，腫瘤細

11、胞分裂相少見。 3.3.2Hep-2/CD組：移植瘤內(nèi)見較多壞死組織及有少量淋巴細胞浸潤。 3.3.3HeF-2/TNF一α組：移植瘤內(nèi)見大量壞死組織及有極少淋巴細胞浸潤。 3.3.4Hep-2/0組：移植瘤內(nèi)見低分化鱗狀細胞腫瘤組織，許多有絲分裂相的腫瘤細胞和瘤巨細胞，而腫瘤壞死及淋巴細胞浸潤不明顯。 結論： 1.成功構建了目的基因真核表載體pcDNA3.1(+)/CD、pcDNA3.1(+)/