婦科復(fù)雜性疾病相關(guān)遺傳位點(diǎn)的確證及功能探索.pdf

1、第一部分TRIO通過(guò)誘導(dǎo)侵襲性偽足形成促進(jìn)宮頸鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移
　　研究背景及目的：宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤，高危型 HPV（human papillomavirus,HPV）持續(xù)性感染是發(fā)病的首要病因。近年來(lái)隨著以高危型人乳頭瘤病毒為基礎(chǔ)的宮頸脫落細(xì)胞檢測(cè)的推廣，宮頸癌新發(fā)病例數(shù)較前已經(jīng)大幅度減少，但是病死率仍然沒(méi)有得到改善，尤其在發(fā)展中國(guó)家，宮頸癌所致病患死亡已位列女性腫瘤相關(guān)性死亡的第二，甚至發(fā)病率和病死率呈現(xiàn)了年輕化

2、的趨勢(shì)。因此，宮頸癌仍然是威脅病患生存的重要因素。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是病患死亡的重要原因，宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移具有一定獨(dú)特性：國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期系統(tǒng)（International Federation of Gynecology and Obstertrics，F(xiàn)IGO）早期宮頸癌病患中已經(jīng)可能有盆腔淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的狀態(tài)是病患預(yù)后的強(qiáng)烈影響因素。腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的獲得依賴于腫瘤細(xì)胞基因組的相應(yīng)改變。為了探索宮頸癌中基因組拷貝數(shù)變

3、異的特征，前期本研究組利用人類(lèi)全基因組CGH芯片篩選出5p15高頻擴(kuò)增片段。本研究驗(yàn)證該高頻擴(kuò)增片段，得到目標(biāo)基因TRIO,并探索 TRIO基因在宮頸癌中的作用以及相關(guān)機(jī)制。
　　材料和方法：收集經(jīng)病理診斷的宮頸癌組織作為病例組，以及因婦科良性疾病切除的正常宮頸組織作為對(duì)照組。提取組織的DNA、RNA，用real-time PCR的方法驗(yàn)證5p15上基因拷貝數(shù)變化，以及mRNA表達(dá)情況。免疫組化探討TRIO在宮頸癌及正常宮頸中的表

4、達(dá)差異，并分析 TRIO表達(dá)對(duì)病患預(yù)后的影響。構(gòu)建TRIO siRNA，轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞系-SiHa細(xì)胞，劃痕，TRANSWELL檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用，熒光標(biāo)記鬼筆環(huán)肽骨架染色檢測(cè)細(xì)胞骨架變化，Western blot檢測(cè)下游通路靶蛋白的變化，利用薄熒光明膠包埋爬片檢測(cè)侵襲性偽足的形成，利用免疫熒光 cortactin熒光染色檢測(cè)侵襲性偽足成熟。
　　結(jié)果：在宮頸癌組織和正常宮頸組織DNA中，發(fā)現(xiàn)TRIO基因的拷貝數(shù)擴(kuò)增頻率最

5、高。利用FISH檢測(cè)基因組拷貝數(shù)證實(shí)TRIO在宮頸癌組織的擴(kuò)增。在表達(dá)水平上，mRNA和蛋白水平都顯示宮頸癌組織中的 TRIO表達(dá)高于正常宮頸（p<0.05）。分析TRIO表達(dá)與各個(gè)級(jí)別宮頸癌以及預(yù)后關(guān)系結(jié)果顯示，TRIO高表達(dá)與宮頸癌的進(jìn)展以及宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。在多因素生存分析中顯示TRIO可能作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因子。構(gòu)建并合成TRIO-siRNA，在SiHa細(xì)胞中的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)下調(diào)TRIO的表達(dá)后，細(xì)胞侵襲遷移能力下降。細(xì)胞骨架的染

6、色顯示沉默TRIO以后SiHa細(xì)胞骨架變得松散。下調(diào)了TRIO以后侵襲性偽足形成減少，成熟也減少。探索 TRIO影響侵襲性偽足形成的下游因素，發(fā)現(xiàn)分別下調(diào)TRIO下游Rac1和RhoA,侵襲性偽足的形成以及成熟均受到影響。Western blot檢測(cè)下游通路蛋白發(fā)現(xiàn) TRIO分別通過(guò) TRIO/Rac1/PAK1和TRIO/RhoA/Rock/MT1-MMP兩條通路影響侵襲性偽足的形成以及成熟。
　　結(jié)論：TRIO過(guò)表達(dá)通過(guò)TRI

7、O/Rac1/PAK1和TRIO/RhoA/Rock/MT1-MMP通路誘導(dǎo)侵襲性偽足的形成誘導(dǎo)宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　第二部分FOXP3，WNT4基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)性研究
　　研究背景及目的：子宮內(nèi)膜異位癥（內(nèi)異癥，EMs）是內(nèi)膜組織在子宮腔以外種植。流行病學(xué)調(diào)查，約有5％-10%的育齡期婦產(chǎn)受其影響，更有高達(dá)50%的不孕癥的婦女罹患內(nèi)異癥。子宮內(nèi)膜異位癥常常導(dǎo)致痛經(jīng)，慢性盆腔疼，性交痛以及繼發(fā)性不孕?，F(xiàn)有研究

8、表明有內(nèi)異癥家族的婦女罹患內(nèi)異癥的風(fēng)險(xiǎn)比無(wú)家族史的增加了近5倍。盡管內(nèi)異癥的病理過(guò)程仍不清楚，但是認(rèn)為內(nèi)異癥是一種有環(huán)境，遺傳以及環(huán)境和遺傳相互作用的多因素疾病。近年來(lái)，內(nèi)異癥 GWAS研究發(fā)現(xiàn)了一批與內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其中包括免疫相關(guān)基因 FOXP3，女性生殖道發(fā)育相關(guān)基因WNT4等。之后多項(xiàng)研究在不同人群中驗(yàn)證這些點(diǎn)。但是卻沒(méi)有得到一致的結(jié)果。因此，本研究采用候選法，在中國(guó)人群中對(duì)FOXP3和WNT4基因多態(tài)性與內(nèi)異癥的

9、關(guān)聯(lián)進(jìn)行探索。
　　材料和方法：抽取符合要求的病患外周血，存于 EDTA-Na的采血管中。利用Quickgene DNA全血試劑盒提取白細(xì)胞的基因組DNA。應(yīng)用MassARRAY-IPLEX技術(shù)和機(jī)制輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜平臺(tái)對(duì)314例子宮內(nèi)膜異位癥患者和358例正常對(duì)照進(jìn)行FOXP3基因分型。利用Taqman探針基因分型技術(shù)對(duì)646例子宮內(nèi)膜異位癥患者和766例正常對(duì)照進(jìn)行WNT4基因分型。
　　結(jié)果：對(duì)FOXP3基

10、因，內(nèi)異癥組和對(duì)照組 rs2280883位點(diǎn)存在 C/T多態(tài)性,rs3761548存在A/C多態(tài)性rs3761549存在C/T多態(tài)性。與對(duì)照組相比，內(nèi)異癥組rs2280883,rs3761549的三種基因型CC,CT,TT分布（P=0.770，OR=0.960；P=0.923,OR=1.013）和等位基因 C,T頻率（P=0.772，OR=0.960；P=0.925，OR=1.013）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，位點(diǎn)rs3761548的3

11、種基因型AA,AC,CC分布（P=0.762，OR=0.958）和等位基因 A,C頻率（P=0.715，OR=0.950）在內(nèi)異癥組和對(duì)照組間的差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按照r-AFS分期，將內(nèi)異癥組分成I-II期和III-IV期。在內(nèi)異癥I-II期和內(nèi)異癥III-IV期患者中，rs2280883，rs3761549基因型 CC,CT,TT分布（P=0.454，OR=1.198,P=0.526，0R=0.909；P=0.220，OR=0.75

12、0，P=0.548，OR=1.094）和等位基因 C,T分布（P=0.473，OR=1.215，P=0.532，OR=0.912；P=0.204，OR=0.737，P=0.558，OR=1.089），分別與對(duì)照組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣，rs3761548位點(diǎn)3種基因型AA,AC,CC（P=0.431，OR=1.211；P=0.508，0R=0.905）和等位基因A,C（P=0.417，OR=1.226；P=0.516，OR=0.908

13、）分別在內(nèi)異癥兩種分期患者中的分布與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)WNT4基因，探索了rs7521902（A/C），rs16826658（G/T），rs7515106（C/T） and rs2235529（A/G）。rs2235529與內(nèi)異癥的發(fā)病相關(guān)(p=1.80E-03，odds ratio[OR],95% confidence interval[CI]=1.311,1.129-1.522)，尤其是分級(jí)為Ⅲ/Ⅳ的病患。其余的三個(gè)點(diǎn)均