HBV相關(guān)疾病遺傳易感性研究及功能驗(yàn)證.pdf

1、研究背景：
　　 在世界范圍內(nèi)超過3.5億人是慢性乙肝病毒(hepatitisBvirus，HBV)攜帶者。部分慢性乙肝患者(chronichepatitisBpatients，CHB)會(huì)進(jìn)一步發(fā)展成終末期肝病，包括肝硬化和肝癌。肝硬化（livercirrhosis，LC）是慢性肝病在發(fā)展過程中持續(xù)性的肝損傷-愈合反應(yīng)導(dǎo)致而成的。肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。研究

2、表明，病毒因素、環(huán)境因素以及宿主的遺傳因素相互作用，影響HBV感染的結(jié)局。其中，宿主細(xì)胞內(nèi)一些重要信號(hào)通路的異常已成為疾病發(fā)生機(jī)制的研究熱點(diǎn)。
　　 轉(zhuǎn)換生長因子β（transforminggrowthfactorbeta，TGF-β）信號(hào)通路可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、纖維化、腫瘤發(fā)生、血管生成以及免疫應(yīng)答等。TGF-β1及其三個(gè)受體，即轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅰ(TβRI)，受體Ⅱ(TβRII)，受體Ⅲ(Tβ

3、RⅢ)在慢性乙肝發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用。此外，血管內(nèi)皮生長因子A（vascularendothelialgrowthfactorA，VEGFA）可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生，并且可以增加血管通透性，因此它在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移過程中扮演著至關(guān)重要的角色。本研究采用病例．對(duì)照的研究方法，以TGF-β信號(hào)通路上的4個(gè)核心家族成員，即TGFβ1、TβRⅠ、TβRⅡ、TβRⅢ為候選基因，以探討HBV相關(guān)疾病遺傳易感性。并通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已篩出的肝癌易感基

4、因VEGFA，進(jìn)行進(jìn)一步的功能驗(yàn)證，將有助于尋找更為合適而有效的治療靶點(diǎn)。
　　 研究方法：
　　 以347例肝癌患者、243例肝硬化患者、708例慢肝患者和881例未感染過HBV且乙肝五項(xiàng)全陰的人群為研究對(duì)象，采用病例．對(duì)照的研究方法，利用PCR-RFLP/TaqMan的檢測方法分析TGF-β1及其三個(gè)受體基因潛在功能區(qū)域上的16個(gè)單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）位點(diǎn)（

5、TGF-β1基因上的rs2317130，rs4803457，rs56719111，rs1800469和rs1800470;TβRⅠ基因上的rs334348，rs334349，rs3739798和rs1590;TβRⅡ基因上的rs2228048;TβRⅢ基因上的rs1805109，rs1805110,rs2810904，rs1805112，rs284878和rs1804506)與HBV相關(guān)疾病遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性。并通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)?/p>

6、驗(yàn)、凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)肝癌易感基因VEGFA啟動(dòng)子區(qū)SNPs影響基因轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行進(jìn)一步的功能驗(yàn)證。
　　 研究結(jié)果：
　　 1．分別進(jìn)行三組病例．對(duì)照研究，分析TGF-β1及其3個(gè)受體基因多態(tài)性與HBV相關(guān)疾病的關(guān)聯(lián)性。
　　 1)以CHB為病例，未感染過HBV且乙肝五項(xiàng)全陰的人群為對(duì)照進(jìn)行研究單位點(diǎn)分析未發(fā)現(xiàn)

7、與CHB易感性相關(guān)聯(lián)的SNPs。
　　 2)以LC為病例，未感染過HBV且乙肝五項(xiàng)全陰的人群為對(duì)照進(jìn)行研究單位點(diǎn)分析未發(fā)現(xiàn)與LC易感性相關(guān)聯(lián)的SNPs。
　　 3)以HCC為病例，未感染過HBV且乙肝五項(xiàng)全陰的人群為對(duì)照進(jìn)行研究單位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，TβRⅢ基因上的rs1805110的T等位基因頻率在病例組中顯著高于對(duì)照組，二者呈現(xiàn)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.034)。
　　 性別分層后分析結(jié)果顯示，在男性中，rs1

8、805110位點(diǎn)的T等位基因頻率在病例組與對(duì)照組的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異更為顯著(P=0.005)，但這種統(tǒng)計(jì)學(xué)差異在女性中不存在。進(jìn)一步進(jìn)行單倍型分析結(jié)果顯示，TβRⅢ基因的5個(gè)SNPs位點(diǎn)組成的單倍型C-C-G-C-A在病例組中的分布頻率顯著低于對(duì)照組(P=0.001)，而單倍型T-C-G-C-A的分布頻率在病例組中顯著高于對(duì)照組(P=0.036)。
　　 2．HCC發(fā)生的易感基因VEGFA的功能驗(yàn)證
　　 1)VEGFA基因啟

9、動(dòng)子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)啟動(dòng)子活性的影響己成功構(gòu)建的4個(gè)表達(dá)質(zhì)粒pGL3-VEGFA-啟動(dòng)子區(qū)域(-1661～+279bp)，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測結(jié)果顯示，rs833061C-rs1570360A質(zhì)粒的表達(dá)活性是rs833061T-rs1570360G表達(dá)活性的2.59倍，二者呈現(xiàn)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.00005）。
　　 2)VEGFA基因18bp插入等位基因與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

10、明，18bp插入等位基因產(chǎn)生一個(gè)與Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的位點(diǎn)。
　　 3)VEGFA的mRNA表達(dá)水平實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HCC患者VEGFA的mRNA表達(dá)水平是CHB患者的5.16倍，是乙肝病毒表面抗原(HBsAg)為陰性的健康人群的6.95倍，在三者間呈現(xiàn)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=1.15e-10）。
　　 研究結(jié)論：
　　 1．HBV相關(guān)疾病遺傳易感性的研究結(jié)果提示，在男性中，位于TβRⅢ基因上的rs