灕了脂肪酸通過NLRP3介導(dǎo)致Kupffer細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究.pdf

1、目的:①探討原位PBS灌注、膠原酶離體消化、梯度離心、選擇性貼壁四步法分離Kupffer細(xì)胞(KCs)的效果。②證實(shí)NLRP3炎癥小體在游離脂肪酸(FFA)激活KCs炎癥反應(yīng)中的作用。③闡述NLRP3在LPS激活KCs炎癥反應(yīng)中的可能作用。④初步明確FFA促進(jìn)LPS激活KCs炎癥反應(yīng)，探討FFA通過激活NLRP3調(diào)節(jié)IL-1β表達(dá)的途徑增加LPS激活KCs炎癥反應(yīng)作用的可能機(jī)制。
　　 方法:①采用原位PBS灌注+膠原酶離體消化

2、+梯度離心+選擇性貼壁四步法分離KCs，根據(jù)具體步驟方法不同隨機(jī)分為3組:無膠原酶原位灌注+PBS梯度離心組（改良A組）、無膠原酶原位灌注+Percoll細(xì)胞分離液密度梯度離心方法組（B組）、膠原酶原位灌注+Percoll細(xì)胞分離液密度梯度離心方法組（C組）。動態(tài)觀察KCs的生存時(shí)間及形態(tài)變化，應(yīng)用F4/80(BM8)標(biāo)記KCs特異抗原，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色及免疫熒光檢測鑒定KCs及判斷純度;吞墨試驗(yàn)了解KCs的吞噬功能，應(yīng)用臺盼藍(lán)拒染

3、試驗(yàn)判斷細(xì)胞的活性，比較不同組別分離方法的KCs得率、活性及純度。②首先分離小鼠KCs觀察不同濃度的FFA對KCs炎癥反應(yīng)影響; KCs隨機(jī)分為5組:Control組，加培養(yǎng)基、0.2mmol/L組、0.3mmol/L組、0.4mmol/L組、0.5mmol/L組;FFA刺激24 h后，Western blot檢測NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time qPCR)檢測NLRP3、Casp

4、ase-1、ASC的mRNA表達(dá)， ELISA檢測KCs培養(yǎng)上清液IL-1β、IL-18的表達(dá)情況。其次了解在固定FFA濃度(0.35mmol/L)對KCs的炎癥反應(yīng)的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，KCs隨機(jī)分5組，對照組加入培養(yǎng)基及相應(yīng)量的BSA、4h組、8h組、12h組、24h組，分別給予0.35mmol/L的FFA刺激，檢測KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白及基因表達(dá)以及IL-1β、IL-18的變化情況。最后KCs隨機(jī)分為4組

5、:Control組加培養(yǎng)基及相應(yīng)量的BSA、FFA組、FFA+NLRP3 siRNA組、FFA+Control shRNA組;shRNA轉(zhuǎn)染KCs后8h通過熒光顯微鏡鑒定轉(zhuǎn)染效果。FFA刺激24 h后，檢測KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白及其基因表達(dá)和IL-1β、IL-18的變化情況，分析NLRP3在FFA致KCs炎癥反應(yīng)中的作用。③首先探討LPS致KCs炎癥反應(yīng)的量效關(guān)系，分離的KCs隨機(jī)分為4組:Control組

6、、LPS組（0.5ug/ml）、LPS（1ug/ml）組、LPS（2ug/ml）組，LPS刺激24h后，檢測KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白及其基因表達(dá)及IL-1β、IL-18的表達(dá)情況。其次分離小鼠KCs隨機(jī)分為4組:Control組、LPS組(1ug/ml)、LPS(1ug/ml)+shRNA組、LPS(1ug/ml)+Control siRNA組，LPS刺激24h，檢測KCs的NLRP3、Caspase-1、A

7、SC的蛋白及其基因表達(dá)以及IL-1β、IL-18的變化情況，分析NLRP3在LPS激活KCs炎癥反應(yīng)中的作用。(4)分離小鼠KCs隨機(jī)分為6組:Control組、FFA組、LPS組、FFA+LPS組、FFA+LPS+shRNA組、FFA+LPS+Control shRNA組;檢測KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白及其基因表達(dá)以及IL-1β、IL-18的表達(dá)情況，分析FFA對LPS激活KCs炎癥反應(yīng)的影響。
　　

8、 結(jié)果:①剛分離的KCs細(xì)胞近似類圓形，接種1h后，此時(shí)收獲細(xì)胞純度較高，但由于貼壁時(shí)間短，部分KCs未貼壁使細(xì)胞得率相對較低，KCs貼壁培養(yǎng)2h后細(xì)胞的得率及純度相對較高。觀察KCs形態(tài)見在熒光顯微鏡下328nm熒光未能激發(fā)KCs發(fā)出熒光，培養(yǎng)2天后，細(xì)胞充分伸展，表現(xiàn)形狀多樣性，可呈現(xiàn)星形或不規(guī)則形，培養(yǎng)KCs最長見存活4周。F4/80免疫細(xì)胞化學(xué)染色及免疫熒光行激光共聚焦顯示分離的細(xì)胞為KCs;吞墨試驗(yàn)表現(xiàn)為KCs吞噬大量碳素顆粒

9、，臺盼藍(lán)染色表現(xiàn)為正常KCs拒染，凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為被染成藍(lán)色，計(jì)數(shù)各組KCs的活性數(shù)目均在90％左右。綜合得率、純度及活性判斷改良法原位PBS灌注+膠原酶離體消化+梯度離心+選擇性貼壁四步法分離KCs與其它兩組無明顯差異，是一種簡便有效分離KCs的方法。②NLRP3shRNA質(zhì)粒能夠高效轉(zhuǎn)染KCs，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后8小時(shí)KCs轉(zhuǎn)染效果可以達(dá)到85％。FFA刺激KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC表達(dá)明顯升高，培養(yǎng)液的IL-

10、1β、IL-18表達(dá)水平明顯升高，同條件干預(yù)組內(nèi)NLRP3、Caspase-1、ASC的表達(dá)趨勢無明顯差異。NLRP3基因沉默可以有效地抑制NLRP3、Caspase-1、ASC及IL-1β、IL-18的表達(dá)。⑨LPS刺激后，KCs的IL-1β、IL-18表達(dá)水平明顯升高，但是NLRP3、Caspase-1、ASC的表達(dá)改變不明顯，NLRP3基因沉默，無明顯抑制LPS激活KCs的 IL-1β、IL-18升高。④FFA明顯增加了KCs對L

11、PS的敏感性，促進(jìn)LPS致的致KCs炎癥反應(yīng)，KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC以及IL-1β、IL-18表達(dá)明顯升高，致炎作用明顯高于單獨(dú)FFA或者LPS的作用，NLRP3基因沉默可以有效地抑制NLRP3、Caspase-1、ASC的表達(dá)，細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-18的含量水平明顯降低。
　　 結(jié)論:①原位PBS灌注+離體膠原酶消化+梯度離心+選擇性貼壁四步法分離法簡化了KCs的提取分離，是一種有效、簡便、經(jīng)

12、濟(jì)的分離KCs的方法。②高濃度的FFA對KCs存在明顯脂毒性，NLRP3炎癥小體介導(dǎo)了FFA誘導(dǎo)的KCs的炎癥反應(yīng)，F(xiàn)FA通過激活KCs的NLRP3、ASC、Caspase-1表達(dá)促進(jìn)分泌IL-1β、IL-18炎癥因子，而激發(fā)KCs在NASH中的炎癥反應(yīng)，阻斷NLRP3信號通路可能是拮抗FFA促進(jìn)NASH的新途徑。③LPS能夠明顯激活KCs產(chǎn)生炎癥反應(yīng)分泌IL-1β、IL-18，但是LPS致KCs炎癥反應(yīng)并不依賴于NLRP3通路。④FF