急性腎損傷生化標志物NGAL免疫學檢測體系及其初步臨床應用.pdf

1、中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin,NGAL)是Kjeldsen等人1993年研究中性粒細胞中92kDa的明膠酶,即MMP-9時發(fā)現(xiàn)的一種新的脂質(zhì)運載蛋白(又名lipocalin)。NGAL存在于中性粒細胞中的過氧化物酶陰性顆粒中,并在人體組織細胞中廣泛分布,如支氣管、胃、小腸、胰腺、腎、前列腺、胸腺等。研究表明,NGAL蛋白具有運輸疏水性小分子、調(diào)節(jié)MMP

2、-9活性、參與體內(nèi)Fe轉(zhuǎn)運等功能,并可能參與免疫炎癥反應以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展,特別是腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移等過程。近年研究發(fā)現(xiàn),NGAL與腎臟關系十分密切。NGAL通過介導鐵的轉(zhuǎn)運來刺激早期原始腎臟系膜細胞轉(zhuǎn)化為腎臟上皮細胞,從而啟動腎臟發(fā)育。此外,NGAL可以通過轉(zhuǎn)運細胞內(nèi)鐵從而消除鐵在細胞內(nèi)堆積引起的細胞損傷,也可以引起白細胞凋亡減輕炎癥反應而發(fā)揮保護腎臟的作用。眾多實驗室和臨床研究表明,腎損傷時NGAL表達明顯增高并分泌釋放入體液中。尤其是

3、尿液中的NGAL水平與腎臟損傷的程度密切相關且很早就表現(xiàn)出來,NGAL被認為是新的早期腎損傷生化標志物。為將NGAL轉(zhuǎn)化入臨床應用,制備特異性NGAL抗體并建立相應的NGAL免疫檢測方法非常重要。在本研究中,我們利用生物信息學工具分析NGAL蛋白的性質(zhì)并通過HEK293T細胞重組表達了重組人NGAL蛋白(rhNGAL)作為抗體制備的篩選原和標準品。以購買的NGAL重組蛋白為免疫原制備出特異性NGAL單克隆抗體并建立起NGAL免疫學檢測方

4、法。在此基礎上以293T細胞表達的rhNGAL為標準品對該方法進行全面的方法學評價,最后對57例臨床標本進行了檢測,初步證明本檢測方法能夠區(qū)分正常標本和腎臟損傷標本NGAL水平的差異。
　　主要研究內(nèi)容和結(jié)果
　　1.pcDNA3.1/HisA-NGAL的構建及其在HEK293T細胞中的表達和純化
　　通過分子生物學軟件工具的預測發(fā)現(xiàn)NGAL蛋白且具有較多的糖基化位點和磷酸化位點,說明NGAL蛋白翻譯后修飾加工和蛋白結(jié)

5、構比較復雜,原核表達的蛋白不易形成正確的蛋白構象,難以獲得理想的檢測抗體。鑒于NGAL分子特點和前期工作經(jīng)驗,本研究利用基因工程技術構建了pcDNA3.1/HisA-NGAL真核表達載體,在HEK293T細胞中表達rhNGAL并進行純化,獲得0.18mgrhNGAL用作制備單克隆抗體篩選原和標準品,為下一步研究奠定必要的基礎。
　　2.抗人NGAL單克隆抗體的制備和鑒定
　　利用購買的NGAL重組蛋白作為免疫原經(jīng)皮下多點注射

6、和腹腔注射途徑免疫Balb/c小鼠,經(jīng)兩次細胞融合和篩選獲得10株分泌抗NGAL的單克隆抗體細胞株,經(jīng)進一步檢測篩選最后制備獲得4株高效特異的抗NGAL單克隆抗體。隨后利用ELISA和WB等方法對4株抗體進行了鑒定:4株抗體亞類如下:1-F2,1-G2和4-H11是IgG1,1-H5是IgG2b。4株抗體抗原結(jié)合力強,特異性良好,不與無關蛋白反應。在IHC染色中4株抗體均可以與腎組織切片中天然抗原結(jié)合,陽性主要定位于腎小管上皮細胞胞漿中

7、。通過截短表達NGAL蛋白和合成B細胞表位肽的方法鑒定抗體的抗原表位,其中單克隆抗體1-H5的B細胞表位位于NGAL蛋白第20至36位氨基酸處。而其余3株抗體無法與截短的NGAL蛋白片段和表位肽反應。本部分工作成功制備了特異性好、效價高的NGAL單克隆抗體,為下一步NGAL免疫學檢測方法的建立奠定了基礎
　　3.NGALELISA定量檢測方法建立和初步臨床應用研究
　　本研究以第二部分制備獲得的高效特異性單克隆抗體為原料,兩

8、兩配對篩選,建立了以1-F2為捕獲抗體,酶標1-G2為檢測抗體的雙抗體夾心ELISA方法。應用棋盤滴定法確定ELISA體系最佳工作條件。通過方法學評價可知本方法線性范圍0~40ng/ml,靈敏度達到4.8ng/ml,平均回收率101.9％,最大批內(nèi)CV≤10.04%,最大批間CV≤9.76%。我們收集了57例臨床尿液標本,其中24例為正常對照組,33例為腎損傷患病組。用本ELISA系統(tǒng)進行樣本檢測,患病組尿液NGAL水平明顯高于正常對照

9、組尿NGAL水平,有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。隨后選取3例腎病患者尿液和1例健康體檢者尿液為抗原,1-F2和1-G2為一抗做WB分析表明腎病患者尿液標本出現(xiàn)陽性條帶而體檢者尿液標本為陰性,表明1-F2和1-G2單克隆抗體能夠識別體液標本中天然抗原。本ELISA檢測體系經(jīng)方法學評價,各方面參數(shù)良好,臨床小樣本檢測與臨床診斷相符,為研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權的NGAL免疫檢測試劑并以此為基礎發(fā)展NGAL其他靈敏快捷的相關醫(yī)學檢驗技術奠定了基礎。