禽白血病標(biāo)準(zhǔn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)抗體候選物的研制.pdf

1、禽白血病(Avian Leukosis，簡(jiǎn)稱AL)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，簡(jiǎn)稱ALV)感染引起的禽類各組織和臟器腫瘤。ALV現(xiàn)已分至A～K11個(gè)亞群，A、B、C、D、E、J和K亞群分離自雞。A～D和J、K亞群為外源性病毒，而E亞群是內(nèi)源性禽白血病病毒，在許多品系雞體內(nèi)極普遍存在，低致病性或無(wú)致病性。
　　為了建立禽白血病檢測(cè)和凈化規(guī)范，本研究開(kāi)展了禽白血病群標(biāo)準(zhǔn)抗原、J和A亞群禽白血病標(biāo)準(zhǔn)抗原候

2、選物和禽白血病群特異性標(biāo)準(zhǔn)單抗、J亞群禽白血病特異性標(biāo)準(zhǔn)單抗、J和A亞群禽白血病特異性標(biāo)準(zhǔn)血清候選物的研究，并以此作為生物學(xué)材料，對(duì)市場(chǎng)上相關(guān)試劑盒進(jìn)行了檢驗(yàn)，獲得良好效果，為進(jìn)一步凈化禽白血病奠定了基礎(chǔ)。
　　一、禽白血病群標(biāo)準(zhǔn)抗原、J和A亞群禽白血病標(biāo)準(zhǔn)抗原候選物的研制
　　p27基因是禽白血病病毒A、B、C、D、J亞群和K亞群共同的高度保守的基因。本研究用表達(dá)禽白血病群特異性抗原GST-p27蛋白的pGEX-6p-1-

3、p27重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物GST-p27進(jìn)行了純化，制備了ALV的重組GST-p27融合蛋白;同時(shí)擴(kuò)增了J亞群禽白血病病毒JS09GY07株、A亞群禽白血病病毒AH10株;對(duì)這些候選物質(zhì)進(jìn)行了ELISA、PCR及IFA鑒定，同時(shí)通過(guò)一系列純粹性、蛋白濃度、TCID50等標(biāo)定，然后經(jīng)過(guò)分裝、物理性狀檢測(cè)及裝量差異系數(shù)分析、細(xì)菌及支原體感染情況鑒定、均一性、穩(wěn)定性以及保存時(shí)間的標(biāo)定，分別制備出了禽白血病群標(biāo)準(zhǔn)抗原、J和A亞群禽白血

4、病標(biāo)準(zhǔn)抗原候選物及其對(duì)應(yīng)的弱陽(yáng)性及陰性抗原，利用這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)市場(chǎng)上用于檢測(cè)禽白血病群特異性抗原p27的試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)市場(chǎng)上的試劑盒良莠不齊，提示在進(jìn)行禽白血病檢測(cè)及凈化工作中選擇市場(chǎng)上相應(yīng)的試劑盒時(shí)應(yīng)予以足夠重視。
　　二、禽白血病群特異性標(biāo)準(zhǔn)單抗、J亞群禽白血病特異性標(biāo)準(zhǔn)單抗、J和A亞群禽白血病特異性標(biāo)準(zhǔn)血清候選物的研制
　　本研究分別復(fù)蘇并擴(kuò)增了針對(duì)禽白血病群特異性抗原p27蛋白的特異性單克隆抗體ALVp27-5

5、D3雜交瘤細(xì)胞株及針對(duì)J亞群禽白血病特異性抗原gp85蛋白的單克隆抗體細(xì)胞株JE9，并分別將狀態(tài)好的ALVp27-5D3雜交瘤細(xì)胞和JE9雜交瘤細(xì)胞腹腔注射6～8周齡的Balb/c雌性小鼠，大量制備ALVp27-5D3及JE9單克隆抗體腹水，并進(jìn)行了純化，制備了禽白血病群特異性標(biāo)準(zhǔn)單抗、J亞群禽白血病特異性標(biāo)準(zhǔn)單抗候選物。
　　用ALV-J通過(guò)肌肉注射途徑對(duì)SPF雞進(jìn)行攻毒，五免十二天采血分離血清，作為J亞群禽白血病特異性標(biāo)準(zhǔn)血清

6、候選物。用ALV-A通過(guò)腹腔注射、滴鼻點(diǎn)眼途徑對(duì)SPF雞進(jìn)行攻毒，二免十二天采血分離血清，作為A亞群禽白血病特異性標(biāo)準(zhǔn)血清候選物。
　　應(yīng)用IFA、ELISA、Western blot等對(duì)制備好的禽白血病群特異性標(biāo)準(zhǔn)單抗、J亞群禽白血病特異性標(biāo)準(zhǔn)單抗、J和A亞群禽白血病特異性標(biāo)準(zhǔn)血清候選物進(jìn)行標(biāo)定，然后進(jìn)行分裝、物理性狀檢測(cè)及裝量差異系數(shù)分析，細(xì)菌及支原體感染、均一性、穩(wěn)定性以及保存時(shí)間等一系列標(biāo)定，最終獲得了抗ALV-J和ALV