禽白血病病毒p27抗原不同檢測方法在禽白血病凈化中的應用與比較.pdf

1、禽白血?。ˋvian Leukemia,AL）是我國雞群中流行最為廣泛的腫瘤性疾病之一。其病原體是禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus,ALV）。自1908年首次報道禽白血病以來，世界各地不斷有該病的報道流行?，F(xiàn)今，我國雞群中普遍存在ALV感染，尤其在我國地方品種雞中感染率較高，對地方品種資源造成嚴重威脅的同時，也給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失，因而對ALV的監(jiān)測和凈化越來越受到業(yè)界的關注。目前，對待檢雞群進行病毒分離或

2、者通過檢測不同樣品中p27抗原確定陽性個體進而淘汰是ALV凈化過程中不可或缺的重要措施。在凈化的過程中，選擇何種樣品和何種檢測手段來確定感染的雞只進行淘汰是實施凈化進而精簡凈化程序的核心，本研究不僅對應用ALV-p27抗原的單克隆抗體進行間接免疫熒光（IFA）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）進行了對比，也對感染雞群中同一樣品的病毒分離及其泄殖腔棉拭子或蛋清p27抗原檢測進行了系統(tǒng)對比，以期為科學設定ALV凈化檢測規(guī)程提供技術指導。

3、>　　1．不同類型雞其泄殖腔棉拭子或蛋清p27抗原檢測與病毒分離相關性分析
　　為探討泄殖腔棉拭子或種蛋中ALV-p27抗原檢測與病毒分離檢測之間的相關性，本研究對幾種不同類型雞群，包括不同方式人工接種A亞群ALV的SPF雞、完成ALV凈化的進口祖代肉雞以及處于ALV凈化過程中的綠殼蛋雞、瑯琊雞、仙居雞、蘆花雞4個地方品系雞，對其進行一一編號后分別對應采集泄殖腔棉拭子或蛋清用 ELISA抗原檢測試劑盒檢測p27抗原，同時無菌采集抗

4、凝血接種DF-1細胞進行ALV的分離鑒定，來觀察和比較泄殖腔棉拭子或種蛋中ALV-p27抗原檢測與病毒分離檢測之間的吻合率。結果顯示，人工感染A亞群ALV的SPF雞群泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原檢測與病毒分離有很高的吻合率，相對于病毒分離法，119次泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原檢測中出現(xiàn)有1例假陽性和3例假陰性；從美國進口的200只祖代肉雞3次采血DF1細胞病毒分離結果均為陰性，而泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原陽性率依次為4.0％（

5、8/200），2.97%（5/168）和2.61%（4/153），平均假陽性率為3.3%（17/521）。相對于病毒分離法，正在實施ALV凈化的不同遺傳背景地方品系雞泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原檢測的假陽性率高達93.2%~100%，還有一定比例假陰性（1/9，1/4，1/3）。本研究大量一一對應比較的數(shù)據(jù)表明，相對于血漿病毒分離法，不同類型雞的泄殖腔棉拭子p27檢測法不僅有很高的假陽性率，還有一定比例漏檢率。在種雞場的ALV凈化過程

6、中考慮到成本，不建議以泄殖腔棉拭子作為檢測材料。本研究將為我國雞群中禽白血病的凈化檢測和臨床鑒別診斷提供參考依據(jù)。
　　2．針對p27蛋白的ELISA與IFA檢測不同亞群ALV的靈敏性比較
　　為了評估以p27單克隆抗體（4F12腹水）進行的IFA檢測與p27抗原的ELISA檢測的靈敏性，本研究將A亞群SDAU14A1株、B亞群SDAU09C2株、J亞群733株及K亞群JS11C1株和JS11C3株四種不同ALV亞群五個毒株

7、分別以細胞維持液做10倍有限梯度稀釋（10-1~10-8），每個稀釋度各取100μL接種于96孔細胞培養(yǎng)板的一列DF-1細胞共8個孔，接種2h后換液維持。每個毒株做3個重復，分別在3、6、9d對細胞培養(yǎng)上清p27抗原進行ELISA檢測，細胞固定進行IFA檢測，Reed-Muench法計算兩種方法測定的病毒TCID50。結果顯示，IFA檢測A、B、J、K各個ALV亞群感染的DF-1細胞時，熒光顯微鏡下均出現(xiàn)特異性綠色熒光信號，而對照組無熒

8、光顯現(xiàn)；與ELISA檢測結果相比，IFA檢測不同ALV亞群時均可檢測到更高的病毒稀釋度和更多的陽性細胞孔；采用Reed-Muench法計算所得ELISA和IFA兩種檢測方法測定的各個病毒毒株TCID50分別是SDAU14A1株10-4.33 TCID50/0.1 mL與10-4.80 TCID50/0.1 mL、SDAU09C2株10-4.50 TCID50/0.1 mL與10-5.43 TCID50/0.1 mL、733株10-5.2

9、0 TCID50/0.1 mL與10-5.43 TCID50/0.1 mL、JS11C1株10-4.80 TCID50/0.1 mL與10-5.20 TCID50/0.1 mL、JS11C3株10-4.67 TCID50/0.1 mL與10-5.33 TCID50/0.1 mL，可以看出，IFA測定的病毒TCID50均明顯高于ELISA。本研究結果證明p27單克隆抗體4F12腹水能夠特異性結合A、B、J、K亞群ALV p27蛋白，以其進