地方品種蘆花雞禽白血病初步凈化研究.pdf

1、禽白血病(AL)是由禽C型反轉(zhuǎn)錄病毒群引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱，可引起雞的良性和惡性腫瘤以及亞臨床感染并導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩、產(chǎn)蛋下降和免疫抑制。近年來(lái)已在中國(guó)雞群中廣泛傳播，對(duì)地方品種雞群的安全構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，并給地方品種雞保種和選育工作帶來(lái)很大的困難。目前實(shí)施AL凈化的國(guó)際經(jīng)典方法常因檢測(cè)材料或檢測(cè)方法的單一造成漏檢。本研究取地方品種蘆花公、母雞的無(wú)菌抗凝血清經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒，并用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清及母雞卵白中的ALV-p

2、27抗原，了解蘆花雞群中ALV的感染狀態(tài)，并隨機(jī)抽取2份經(jīng)ELISA檢測(cè)上清呈陽(yáng)性的CEF提取前病毒cDNA進(jìn)行ALV亞型的鑒定;同時(shí)用不同檢測(cè)方法對(duì)同一批雞的不同材料進(jìn)行檢測(cè)，探究不同檢測(cè)材料與不同檢測(cè)方法之間的相關(guān)性，優(yōu)化ALV檢測(cè)方法以降低ALV漏檢率。并在此基礎(chǔ)上對(duì)該種雞群后代進(jìn)行追蹤檢測(cè)，以較早實(shí)現(xiàn)對(duì)蘆花雞AL的凈化工作。此外，本文還探究了雞群ALV感染狀態(tài)與NDV、AIV-H5及AIV-H9疫苗免疫抗體水平相關(guān)性以及雞群AL

3、V感染狀態(tài)與雞群雞白痢陽(yáng)性率相關(guān)性。
　　1蘆花雞群感染狀態(tài)調(diào)查
　　為了解江蘇某雞場(chǎng)蘆花雞ALV的感染狀態(tài)，對(duì)來(lái)自該雞場(chǎng)種雞群1024枚種蛋（508只雞兩枚，8只雞一枚）以及對(duì)應(yīng)516只母雞無(wú)菌抗凝血清、232份公雞無(wú)菌抗凝血清及精液接種CEF9d后的細(xì)胞上清中的ALV-p27抗原進(jìn)行ELISA方法檢測(cè)，結(jié)果顯示母雞卵白陽(yáng)性檢出率為20.7％(107/516)，母雞無(wú)菌抗凝血陽(yáng)性檢出率為2.52％(13/516)。公雞精液

4、陽(yáng)性檢出率為15.1％(35/232)，無(wú)菌抗凝血陽(yáng)性檢出率為1.29％(3/232)。病毒分離鑒定結(jié)果顯示蘆花雞群存在ALV-J(LH14J)感染，與國(guó)內(nèi)外參考毒株ADOL-7501、NX0101、SD9901、WN100403、HPRS-103的同源性為87.4％-97.8％，其中與國(guó)外分離株的同源性最高。檢測(cè)結(jié)果表明該蘆花雞群存在一定程度的外源性ALV感染。母雞的卵白和無(wú)菌抗凝血兩種檢測(cè)材料不能相互替代，均需檢測(cè)。
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5、ALV檢測(cè)材料及方法優(yōu)化研究
　　為了避免檢測(cè)材料和方法的單一造成漏檢現(xiàn)象，本研究對(duì)公母雞無(wú)菌抗凝血清提取了RNA進(jìn)行斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)，另外又采集232份對(duì)應(yīng)公雞精液接種CEF培養(yǎng)9d后對(duì)細(xì)胞上清中的ALV-p27抗原進(jìn)行ELISA檢測(cè)。結(jié)果顯示公母雞斑點(diǎn)雜交的陽(yáng)性率為5.88％(44/748)，其中母雞血樣斑點(diǎn)雜交與卵白的陽(yáng)性吻合率為30.0％(6/20)，與母雞血樣CEF上清的陽(yáng)性吻合率為30.0％(6/20)，公雞血樣斑點(diǎn)雜交與

6、其血樣CEF上清陽(yáng)性吻合率為12.5％(3/24);公雞精液陽(yáng)性檢出率為15.1％(35/232)，與其血樣CEF上清陽(yáng)性吻合率為8.6％(3/35)。
　　本研究結(jié)果表明:單一檢測(cè)卵白、抗凝血或精液并不能檢出所有ALV陽(yáng)性雞，不同檢測(cè)材料的相互補(bǔ)充驗(yàn)證才能確保ALV陽(yáng)性雞檢出率，在ALV的凈化進(jìn)程中除對(duì)蘆花雞母雞卵白、公母雞抗凝血經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒后的ELISA檢測(cè)這一經(jīng)典方法之外，可將加測(cè)精液并兼顧血清中RNA的提取及斑點(diǎn)雜交

7、等技術(shù)手段作為ALV經(jīng)典凈化方法的有力補(bǔ)充。另外，本研究經(jīng)卵白檢出的107只陽(yáng)性雞有三種形式，其中兩枚蛋均為陽(yáng)性雞只93只，占86.9％，兩枚蛋一枚陰性一枚陽(yáng)性的雞只12只，占11.2％，只有一枚蛋且為陽(yáng)性雞只2只，占1.9％。本研究結(jié)果顯示ALV檢測(cè)時(shí)增加同一宿主的樣本數(shù)量也可有效降低ALV漏檢率。
　　3對(duì)種雞群后代的追蹤檢測(cè)
　　為了了解對(duì)該種雞群AL的凈化效果，本研究又采集了1320份該種雞群后代子雞群的無(wú)菌抗凝血進(jìn)

8、行病毒分離，結(jié)果顯示，該子代雞群的ALV陽(yáng)性檢出率為0.3％(4/1320)，與其親代種雞群無(wú)菌抗凝血ALV陽(yáng)性檢出率2.14％(16/748)相比，陽(yáng)性率降低非常明顯，說(shuō)明對(duì)該蘆花雞雞群的凈化取得了一定的成果。
　　4雞群ALV感染狀態(tài)與NDV、AIV-H5及AIV-H9疫苗免疫抗體水平以及雞群白痢陽(yáng)性率相關(guān)性研究
　　取不同梯度OD值（陰性、OD0.2-0.3、OD0.5-0.6、OD0.8-0.9、OD1-2、OD2以

9、上）ALV-p27抗原陰陽(yáng)性雞蛋各15枚，檢測(cè)各組樣品NDV、H5、H9抗體滴度。結(jié)果顯示蘆花雞群中NDV、H5、H9抗體水平均是只有個(gè)別p27抗原陽(yáng)性組較陰性對(duì)照組偏低，差異顯著(p≤0.05)，其他各組抗體水平無(wú)明顯相關(guān)性。但整體NDV抗體水平ALV陽(yáng)性雞蛋較陰性雞蛋抗體水平偏低(8.9±1.106 VS9.8±0.145)，差異顯著，H5抗體水平ALV陽(yáng)性雞蛋與陰性雞蛋抗體水平差異不顯著(7.9±0.457 VS8.2±0.223