Neuromedin U2受體激動(dòng)劑高通量篩選模型與天然產(chǎn)物活性成分研究.pdf

1、化合物活性篩選是創(chuàng)新藥物研究的起點(diǎn)和具有決定意義的步驟，是源頭創(chuàng)新和持續(xù)創(chuàng)新的關(guān)鍵。離開篩選，就無從發(fā)現(xiàn)具有某種特定生物活性的新型化學(xué)物質(zhì)，新藥的研究開發(fā)就將成為無源之水。但是，這種基本技術(shù)能力恰恰是我國創(chuàng)新藥物研制中最為突出的薄弱環(huán)節(jié)，成為制約醫(yī)藥工業(yè)轉(zhuǎn)型的“瓶頸”之一。傳統(tǒng)的動(dòng)物篩選模式勞動(dòng)強(qiáng)度大，效率低。近年來，隨著分子生物學(xué)、分子藥理學(xué)和自動(dòng)化技術(shù)的發(fā)展，高通量藥物篩選(Highthroughputscreening，HTS)成

2、為藥物早期發(fā)現(xiàn)的重要手段，它是利用藥靶的分子或細(xì)胞水平的生物學(xué)機(jī)制，以微孔板為基礎(chǔ)，進(jìn)行大量篩選，找到能選擇性作用于藥靶的活性化合物，具有微量、快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。 NeuromedinU(NMU)是高效表達(dá)在腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種神經(jīng)多肽，大鼠禁食48小時(shí)后下丘腦中NMU的mRNA水平降低，提示該神經(jīng)多肽可能涉及飲食行為。事實(shí)上，在大鼠腦內(nèi)注射NMU將降低其食欲。已發(fā)現(xiàn)孤兒G蛋白偶聯(lián)受體FM-4是NMU的一個(gè)內(nèi)源受體(取

3、名為NMU2受體或NMU2R)，雜交分析表明，NMU2受體高效表達(dá)在下丘腦的室旁核，屬Gq蛋白偶聯(lián)受體，用NMU激活NMU2受體轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞株能增加細(xì)胞內(nèi)的鈣信號。為了進(jìn)一步了解NMU2受體的生理功能和開展抗肥胖新藥研究，作者建立了NMU2受體激動(dòng)劑的高通量篩選模型，并以天然產(chǎn)物為資源，篩選和鑒定了NMU2受體的激動(dòng)劑。 建立了人NMU2受體基因質(zhì)粒(hNMU2R/pcDNA3.1)和一個(gè)能同時(shí)響應(yīng)Gs、Gi和Gq受體

4、的報(bào)告基因質(zhì)粒(MRE/CRE/SRE/LUC)，并將NMU2受體質(zhì)粒和報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞，通過G418篩選，建立了穩(wěn)定的hNMU2受體激動(dòng)劑篩選細(xì)胞株。當(dāng)化合物與膜表面的NMU2受體結(jié)合后，激活NMU2受體對應(yīng)的信號級聯(lián)反應(yīng)，改變胞內(nèi)第二信使的表達(dá)水平，響應(yīng)元件響應(yīng)這種變化，促進(jìn)報(bào)告基因的表達(dá)，通過檢測細(xì)胞質(zhì)中報(bào)告基因的表達(dá)量，間接評估化合物的生物活性。 為了有效排除篩選過程中的假陽性和假陰性，同時(shí)建立了只含

5、報(bào)告基因質(zhì)粒的陰性細(xì)胞株和其它受體(MC4R、M1R)篩選細(xì)胞株。 利用cAMP響應(yīng)元件CRE的激活劑Forskolin和受體內(nèi)源激動(dòng)劑探索和優(yōu)化了熒光素酶表達(dá)時(shí)間、每孔細(xì)胞數(shù)目、溶劑DMSO終濃度、熒光素酶底物濃度等篩選實(shí)驗(yàn)條件，建立了可靠的篩選方法。結(jié)果顯示，NMU2R、MC4R、M1R篩選細(xì)胞株最適宜條件為：細(xì)胞數(shù)目4～8×104個(gè)/孔、激動(dòng)劑孵育時(shí)間6～8h、每孔DMSO終濃度小于1％、熒光素酶底物終濃度為12.5％(V

6、％)；篩選模型Z'-因子分別為0.75、0.67和0.7，適用于NMU2R、MC4R和M1R激動(dòng)劑的高通量篩選。 利用建立的篩選模型，對211種天然產(chǎn)物水提物進(jìn)行了小規(guī)模篩選，發(fā)現(xiàn)127種天然產(chǎn)物水提物對NMU2受體有活性，通過對其中部分天然產(chǎn)物分離、純化及鑒定，發(fā)現(xiàn)一些具有特殊結(jié)構(gòu)的黃酮甙化合物激活或部分激活NMU2受體，但它們不能激活MC4、M1受體細(xì)胞株和陰性細(xì)胞株響應(yīng)，提示這些黃酮甙化合物可能是NMU2受體的激動(dòng)劑或部分