PPARγ激動(dòng)劑體外篩選模型的建立及其應(yīng)用.pdf

1、背景
　　2型糖尿病是由多種因素引起的機(jī)體組織對(duì)胰島素敏感性降低而導(dǎo)致的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。隨著生活水平的提高，在營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩、久坐少動(dòng)時(shí)間增加及工作壓力過(guò)大的交叉影響下，糖尿病的發(fā)生率在快速攀升。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)公布的數(shù)據(jù)，目前全球有3.71億糖尿病患者，而中國(guó)糖尿病患者人數(shù)已超過(guò)9200萬(wàn)，其中90％以上的糖尿病屬于2型糖尿病。糖尿病已成為繼腫瘤和心腦血管疾病之后威脅我國(guó)國(guó)民健康的第三大疾病。
　　過(guò)氧化物酶體增殖物

2、激活受體γ(peroxisome proliferator-activatedreceptorγ，PPARγ)是一種配體激活的核受體轉(zhuǎn)錄因子，在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。噻唑烷二酮類(lèi)（Thiazolidinediones，TZDs）藥物，如羅格列酮，是PPARγ的激動(dòng)劑，能夠改善胰島素抵抗，主要用于治療2型糖尿病。
　　基于細(xì)胞水平轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，PPARγ激動(dòng)劑可分為完全激動(dòng)劑和部分激動(dòng)劑。羅格列酮通常被看作是PPARγ完全激動(dòng)

3、劑。與PPARγ完全激動(dòng)劑相比PPARγ部分激動(dòng)劑具有相似的胰島素增敏作用，并且副作用更少，具有更好的安全性。因此有必要去尋找新的安全有效的PPARγ部分激動(dòng)劑。
　　方法:用LipofectamineTM2000將含有PPARγ基因質(zhì)粒(pIRES-PPARγ)、螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（pPPRE×3-TK-Luciferase）以及內(nèi)參照質(zhì)粒(pRL-TK)按不同比例共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，并對(duì)三種質(zhì)粒比例進(jìn)行優(yōu)化;用不

4、同配體處理轉(zhuǎn)染三種質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶相對(duì)活性以確定加入配體對(duì)PPARγ的激動(dòng)效應(yīng);采用經(jīng)典的PPARγ激動(dòng)劑和PPARγ特異性拮抗劑，其他核受體激動(dòng)劑以及PPARα激動(dòng)劑考察不同化合物對(duì)PPARγ的激動(dòng)程度，確定模型的特異性;以Z'值考察模型重復(fù)性;并觀察了PPARγ激動(dòng)劑的作用時(shí)間特點(diǎn)。
　　在篩選的候選化合物中，化合物CMHX(00)8有較好的PPARγ激動(dòng)活性;3T3-L1細(xì)胞按常規(guī)誘導(dǎo)分化，在分化第2

5、天加入CMHX(00)8和羅格列酮，在分化第7天分別進(jìn)行油紅O染色，形態(tài)學(xué)上觀察細(xì)胞分化程度;在490nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量，考察細(xì)胞脂質(zhì)合成能力;Q-PCR和ELISA方法進(jìn)一步研究CMHX(00)8對(duì)脂聯(lián)素和aP2表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:PPARγ質(zhì)粒、報(bào)告基因質(zhì)粒以及內(nèi)參照質(zhì)粒比例為2∶6∶1時(shí)相對(duì)熒光素酶活性最高;PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮可顯著增加相對(duì)熒光素酶的活性而GW9662可抑制這種作用，且相對(duì)熒光

6、素酶的活性隨著處理時(shí)間的增加而升高;地塞米松，全反式維甲酸，雌二醇和非諾貝特?zé)o上述活性;根據(jù)9次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算Z'值為0.70。CMHX(00)8能夠增加PPARγ的活性，但作用強(qiáng)度低于羅格列酮;油紅O染色和TG含量結(jié)果表明CMHX(00)8能夠促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)沉積，但程度均較羅格列酮弱; Q-PCR和ELISA結(jié)果顯示CMHX(00)8具有類(lèi)似羅格列酮增加脂聯(lián)素表達(dá)和分泌的能力，但對(duì)aP2表達(dá)的促進(jìn)作用要顯著低于