新型黑皮質(zhì)素受體4激動劑的設(shè)計、合成與活性評價.pdf

1、黑皮質(zhì)素受體(melonocortin receptors,MCR)參與調(diào)節(jié)生物體許多生理行為,包括能量平衡、色素沉降、性行為、炎癥、心腦血管功能、進(jìn)食行為、皮脂腺脂肪分泌等等。它是G-蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors, GPCR)的一個亞家族,具有七次跨膜結(jié)構(gòu)。已知五種黑皮質(zhì)素受體亞型,分別為MC1R、MC2R、MC3R、MC4R以及MC5R。其中,MC4R的激動劑在治療肥胖癥以及性功能障礙等方面密

2、切相關(guān),有潛在的應(yīng)用價值。
　　Bremelanotide(PT-141)是美國Palatin公司研發(fā)的一種用于治療男女性功能障礙的環(huán)七肽MC4R激動劑,其鼻噴劑由于升高血壓的副作用被美國FDA拒絕批準(zhǔn)進(jìn)入III期臨床實驗;而研發(fā)者認(rèn)為,少數(shù)受試者出現(xiàn)的血壓升高的副作用可能是由于鼻噴劑帶來的藥物吸收濃度過高引起的,隨后進(jìn)行的皮下注射給藥I期臨床實驗沒有發(fā)現(xiàn)血壓升高副作用。他們計劃進(jìn)行皮下注射給藥的II期臨床實驗來進(jìn)一步驗證這種推測

3、。此外,PT-141及其酰胺類似物MT-II以及禮來公司研發(fā)的一系列黑皮質(zhì)素類二硫橋環(huán)肽在治療肥胖癥方面展示了較好的生物活性。
　　本課題的主要目的就是在文獻(xiàn)調(diào)研和課題組前期工作的基礎(chǔ)上,以PT-141、MT-II及禮來公司研發(fā)的Ac-DArg-c(Cys-Glu-His-DPhe-Arg-Trp-Cys)-NH2為陽性對照,尋找新型MC4R激動劑,為新藥研發(fā)打下基礎(chǔ)。同時對黑皮質(zhì)素類似物的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行研究,并進(jìn)一步考察黑皮質(zhì)素類

4、似物和黑皮質(zhì)素受體的相互作用機理。
　　結(jié)合文獻(xiàn)和本實驗室前期工作,在構(gòu)效關(guān)系研究的基礎(chǔ)上,本課題設(shè)計合成了環(huán)肽、線型肽以及小分子三大類共45個目標(biāo)化合物。其中,環(huán)肽30個,線型七肽2個, C端修飾四肽11個,小分子2個。環(huán)肽又分為含有N-取代甘氨酸(NSG)單體的環(huán)肽、不同位置成環(huán)的環(huán)肽以及生物素選擇性修飾的環(huán)肽;線型四肽主要是圍繞黑皮質(zhì)素類似物的藥效團“His-D-Phe-Arg-Trp”、在C端引入了一系列脂肪性或芳香性基團

5、;小分子類似物也是基于藥效團,以哌嗪為骨架,設(shè)計了2個藥效團的小分子模擬物。這些結(jié)構(gòu)均未見文獻(xiàn)或?qū)＠麍蟮馈?br>　　根據(jù)課題設(shè)計的需要,本文合成了5個保護的非天然氨基酸單體,其中有四個芴甲氧羰基(fluorenylmethyloxycarbonyl,Fmoc)保護的NSG衍生物,一個Fmoc保護的生物素修飾的4-胺基-D-苯丙氨酸(Fmoc-D-Aph(Biotin)-OH)。其中后者未見文獻(xiàn)報道。在進(jìn)行了多種縮合試劑以及反應(yīng)條件的摸

6、索后,找到了一條收率較高的合成路線。所有目標(biāo)單體都通過氫譜、質(zhì)譜、熔點測定等手段進(jìn)行了鑒定和表征。
　　根據(jù)結(jié)構(gòu)類型不同,對目標(biāo)化合物的合成我們采取了相應(yīng)的合成策略。對于酰胺鍵成環(huán)的環(huán)肽目標(biāo)化合物,我們采用常規(guī)的逐步固相多肽合成方法手動合成;對于二硫鍵成環(huán)的環(huán)肽目標(biāo)化合物,我們采用固相合成線型肽前體、液相成環(huán)的方法;對C端修飾的四肽,我們首先利用2-氯-三苯甲基氯樹脂,通過固相合成得到全保護的四肽片段,然后液相與各種胺基試劑反應(yīng),

7、最后脫除保護基并進(jìn)行純化;對于小分子化合物的合成,我們采用類似多肽液相縮合的方法。利用中壓C18反相色譜對所有目標(biāo)化合物進(jìn)行了純化,最后冷凍干燥得到產(chǎn)物。利用ESI-MS進(jìn)行了分子量鑒定。
　　黑皮質(zhì)素類似物的生物活性評價通常采用放射性配體受體結(jié)合實驗以及刺激細(xì)胞釋放環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的功能實驗。前者評價化合物與受體的親和力,后者評價化合物的激動/拮抗活性。通過與放

8、射性配體I125-α-黑素細(xì)胞刺激激素( I125-α-melanocyte stimulating hormone, I125-α-MSH)競爭結(jié)合受體的實驗方法,以SD大鼠腦組織提取的富含MC4R的膜蛋白為靶標(biāo),對設(shè)計合成的45個黑皮質(zhì)素類似物分別在10nM和100 nM兩個濃度下進(jìn)行了MC4R親和力的篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在100nM濃度下,有15個化合物抑制率達(dá)到了50％;在10nM濃度下,有6個化合物抑制率達(dá)到了50％,與陽性對照相

9、當(dāng)。其中,LK-FS-G11與LK-FS-B01在兩個濃度下都顯示了與陽性對照相當(dāng)?shù)氖荏w親和力。
　　初步構(gòu)效關(guān)系表明:1)將成環(huán)位置氨基酸替換為含有相同側(cè)鏈官能團的NSG單體,在一定程度上保留了MC3R和/或MC4R親和力;2)環(huán)肽對MC3R和/或MC4R的親和力大于相應(yīng)的線肽,MT-II中成環(huán)位置改變將導(dǎo)致MC3R和/或MC4R親和力下降;3)N端生物素修飾,基本保持MC3R和/或MC4R親和力,D-Phe4位置引入生物素,導(dǎo)

10、致親和力喪失;4)在含二硫橋的環(huán)肽中,His替換為Tal或Mtal可能會導(dǎo)致MC3R和/或MC4R親和力下降;5)Nle用Aca替換或去除后可能會導(dǎo)致MC3R和/或MC4R親和力降低;6)D-Phe4替換為D-Cpa可能會提高M(jìn)C3R和/或MC4R親和力;7)N端引入含羧基的極性基團,可能會導(dǎo)致MC3R和/或MC4R親和力降低;8)在100nM以及10nM水平,小分子和C端修飾四肽對MC3R和/或MC4R親和力較弱。
　　由于受體