酸性鞘磷脂酶及神經(jīng)酰胺在工頻磁場誘導(dǎo)FL細(xì)胞膜受體聚簇中的作用.pdf

1、極低頻電磁場(ELF EMF)通常是指頻率為0—300Hz的交變電磁場。工頻磁場是一類由50 Hz或60 Hz交變電流所產(chǎn)生的極低頻電磁場，其通常存在于家用電器、工農(nóng)業(yè)電器設(shè)備及輸變電設(shè)施周圍。伴隨著電力事業(yè)的發(fā)展以及各類電器設(shè)備的廣泛應(yīng)用，人類工作與生活環(huán)境中的工頻磁場日益增強，逐漸成為繼水、空氣、固體垃圾污染之后的又一主要環(huán)境污染源，并已被聯(lián)合國人類環(huán)境會議列為必須控制的污染。眾多的研究表明，工頻磁場作為一類普遍存在的物理刺激因子可

2、誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生多種生物效應(yīng)，其暴露可能與腫瘤的發(fā)生，心血管、內(nèi)分泌等系統(tǒng)疾患以及生殖和發(fā)育的異常相關(guān)，因而引起了研究人員的廣泛關(guān)注和公眾的迫切關(guān)心，但是，工頻磁場誘導(dǎo)的生物效應(yīng)的機制至今尚未闡明。因此，探索外界工頻磁場究竟通過何種機制將自身的物理信號傳遞給生物體，并產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，已成為該研究領(lǐng)域急需解決的難題。有關(guān)的研究顯示，各類外界刺激因子所誘導(dǎo)的受體聚簇是膜受體及其下游信號通路活化的基礎(chǔ)。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，50 Hz工頻磁

3、場不僅可誘導(dǎo)細(xì)胞膜表面的表皮生長因子受體(EGFR)和腫瘤壞死因子受體(TNFR)發(fā)生聚簇，而且，工頻磁場誘導(dǎo)的EGFR聚簇與細(xì)胞膜上富含鞘脂類和膽固醇的脂筏結(jié)構(gòu)(lipid rafts)的融合匯集密切相關(guān)。因此，我們推測細(xì)胞膜上的受體以及脂筏結(jié)構(gòu)可能是工頻磁場作用于細(xì)胞并發(fā)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵作用位點。相關(guān)的研究結(jié)果提示，胞膜上脂筏結(jié)構(gòu)的聚集以及膜受體的聚簇與胞膜中酸性鞘磷脂酶(A-SMase)的活性和神經(jīng)酰胺(Ceramide)的含量具

4、有密切的相關(guān)性。配體及非配體等眾多外界刺激因素誘導(dǎo)的脂筏結(jié)構(gòu)聚集以及相關(guān)受體的聚簇往往是外界刺激因子激活跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一大共同機制.有研究表明，外界刺激因子誘導(dǎo)受體聚簇通常遵循類似的作用過程：包括刺激因子作用下誘導(dǎo)胞內(nèi)的A-SMase活化、易位至細(xì)胞膜，水解脂筏中的鞘磷脂產(chǎn)生神經(jīng)酰胺，誘導(dǎo)脂筏結(jié)構(gòu)融合匯集，最終導(dǎo)致脂筏上相應(yīng)受體發(fā)生聚簇。這些非配體刺激因素中也包括了與工頻磁場同為電磁輻射的紫外線UV-C，電離輻射Y射線等物理刺激因素。神

5、經(jīng)酰胺作為體內(nèi)一種重要的第二信使，由其為基本組成單位構(gòu)成的神經(jīng)鞘磷脂是細(xì)胞膜的基本組成成分。隨著細(xì)胞跨膜信號通路研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)鞘脂類物質(zhì)，特別是神經(jīng)酰胺在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多方面扮演著重要的角色。而酸性鞘磷脂酶活化、易位后可以水解胞膜中的鞘磷脂產(chǎn)生神經(jīng)酰胺。相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中的許多刺激因子可通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平(ROS)發(fā)生增高而致使酸性鞘磷脂酶發(fā)生活化和易位，ROS與酸性鞘磷脂酶的活化具有密切相關(guān)性。我們在以往的研究中觀

6、察到工頻磁場可導(dǎo)致酸性鞘磷脂酶易位至胞膜上，并與脂筏發(fā)生共定位，因此，我們推測酸性鞘磷脂酶以及神經(jīng)酰胺和ROS在工頻磁場誘導(dǎo)的受體聚簇中發(fā)揮著重要作用。
　　 本研究以0.4 mT的工頻磁場輻照處理人羊膜(FL)細(xì)胞，利用激光共聚焦顯微鏡免疫熒光技術(shù)較系統(tǒng)地探討A-SMase和神經(jīng)酰胺在工頻磁場誘導(dǎo)細(xì)胞膜受體聚簇中的作用；并采用活性氧檢測技術(shù)初步地分析工頻磁場輻照對FL細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的影響。采用免疫組織化學(xué)熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合激

7、光共聚焦顯微鏡觀察，并引入酸性鞘磷脂酶的抑制劑——丙咪嗪(Imipramine)以研究酸性鞘磷脂酶活性與工頻磁場誘導(dǎo)的FL細(xì)胞膜受體聚簇之間的關(guān)系。實驗時，F(xiàn)L細(xì)胞接種于置有蓋玻片的φ35 mm的培養(yǎng)皿中，隨機分為Imipramine預(yù)處理組(Imipramine溶于二甲亞砜配成母液，實際使用中稀釋至50μmol/L預(yù)處理4h)、二甲亞砜溶劑預(yù)處理組(預(yù)處理4h)和常規(guī)培養(yǎng)組(非預(yù)處理組)。每組細(xì)胞再各設(shè)3種處理組，分別為：(1)假輻照

8、組，不作任何處理；(2)磁場輻照組，0.4 mT工頻磁場持續(xù)輻照15 min；(3)EGF陽性對照組，100 ng/ml EGF處理15 min。處理后的細(xì)胞依次以PBS漂洗，4％多聚甲醛固定，羊血清封閉，抗體標(biāo)記以及封片，最后以激光共聚焦顯微鏡觀察FL細(xì)胞膜EGF受體聚簇的變化，同時對細(xì)胞膜受體聚簇的百分比進行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示常規(guī)培養(yǎng)及DMSO溶劑預(yù)處理組中，EGF處理和0.4 mT工頻磁場輻照15min均能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的EGF

9、受體聚簇現(xiàn)象，圍繞細(xì)胞表面呈明亮的、聚集狀的綠色熒光團，或形成極性帽狀光團；而假輻照細(xì)胞的EGF受體基本呈均勻分散分布熒光小點，幾乎不出現(xiàn)聚集狀的光團。細(xì)胞計數(shù)結(jié)果表明，與假輻照組相比，工頻磁場輻照組及EGF處理組中發(fā)生受體聚簇細(xì)胞的百分比均顯著增加。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過丙咪嗪預(yù)處理4h后，細(xì)胞受體聚簇現(xiàn)象則減弱或消失。發(fā)生受體聚簇細(xì)胞的百分比也明顯減少，與假輻照相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，基本恢復(fù)至本底水平。溶劑DMSO對細(xì)胞表面EGF受體聚簇的發(fā)

10、生率沒有影響。表明工頻磁場誘導(dǎo)的FL細(xì)胞受體聚簇與酸性鞘磷脂酶活性具有密切的相關(guān)性。采用免疫組織化學(xué)熒光標(biāo)記技術(shù)以及激光共聚焦顯微鏡觀察方法，來分析神經(jīng)酰胺對工頻磁場誘導(dǎo)細(xì)胞膜受體聚簇的影響。接種于含有蓋玻片的培養(yǎng)皿中的細(xì)胞經(jīng)丙咪嗪預(yù)處理4h之后，被隨機分為C2-神經(jīng)酰胺處理組(神經(jīng)酰胺溶于DMSO配成母液，實際使用中稀釋至50μg/ml預(yù)處理30 min)及常規(guī)培養(yǎng)(非處理組)。每組再各設(shè)3種處理組，分別為：(1)假輻照組，不作任何處

11、理；(2)磁場輻照組，0.4 mT工頻磁場持續(xù)輻照15 min；(3)EGF陽性對照組，100 ng/ml EGF處理15 min。結(jié)果顯示丙咪嗪預(yù)處理4h后，EGF處理和0.4 mT工頻磁場輻照15 min均不能增強細(xì)胞EGF受體聚簇，與假輻照相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。丙咪嗪預(yù)處理4 h后的細(xì)胞再經(jīng)神經(jīng)酰胺預(yù)處理30 min，EGF處理組和0.4 mT工頻磁場輻照組均能觀察到較為明顯的EGF受體聚簇現(xiàn)象。與假輻照組相比，

12、工頻磁場輻照組及EGF處理組中發(fā)生受體聚簇細(xì)胞的百分比均顯著增加。結(jié)果表明，神經(jīng)酰胺作為A-SMase的水解產(chǎn)物可能參與了工頻磁場誘導(dǎo)的FL細(xì)胞膜受體聚簇。應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測技術(shù)對0.4 mT工頻磁場輻照處理下Fl細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平進行探索。FL細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加載相應(yīng)濃度的熒光探針DCFH-DA，然后分為5組，分別為：(1)假輻照組，不作任何處理；(2)磁場輻照組，0.4 mT，50Hz工頻磁場分別持續(xù)輻照5、15或30 nun

13、；(3)陽性對照組，活性氧陽性對照試劑處理30 min。每次實驗每組均設(shè)8個復(fù)孔，同時每組都設(shè)立相同數(shù)量不加熒光探針DCFH-DA，而其它條件相同的背景孔(組).輻照組細(xì)胞在距收獲前相應(yīng)的時間放置于輻照系統(tǒng)中進行輻照，所有細(xì)胞同時收獲。收獲后利用熒光酶標(biāo)儀對各組細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平進行檢測并對細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的變化情況進行t檢驗統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，經(jīng)0.4 mT工頻磁場輻照處理5，15或30 min后，F(xiàn)L細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平有增加的趨勢，