工頻磁場誘導(dǎo)FL細(xì)胞膜受體聚簇的鞘脂類代謝機(jī)制研究.pdf

1、工頻磁場是一類由50 Hz或60 Hz交變電流所產(chǎn)生的極低頻電磁場，它通常存在于工農(nóng)業(yè)電器設(shè)備、家用電器及輸變電設(shè)施周圍。伴隨電力與電器設(shè)備的廣泛應(yīng)用而日益增強(qiáng)的工頻磁場已經(jīng)成為繼水、空氣和固體垃圾污染之后的第四大環(huán)境污染源。 作為一類普遍存在的物理刺激因子，有研究表明，工頻磁場可誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生多種效應(yīng)，但是外界電磁場究竟是通過何種機(jī)制將自身的物理信號傳達(dá)給生物體，并產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，成為生物電磁學(xué)研究領(lǐng)域一個亟待解決的難題

2、．在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，一定強(qiáng)度的50 Hz工頻磁場可誘導(dǎo)細(xì)胞膜表面的受體發(fā)生聚簇，包括細(xì)胞表皮生長因子受體(EGFR)和腫瘤壞死因子受體(TNFR)等。同時，在同等強(qiáng)度下，工頻磁場能夠磷酸化胞內(nèi)應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)和P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)兩種關(guān)鍵酶。因此，我們推測細(xì)胞膜，尤其是細(xì)胞膜受體，可能是電磁場作用于細(xì)胞并發(fā)生生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要位點(diǎn)之一． 研究表明，受體聚簇及其后續(xù)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞膜的脂筏結(jié)構(gòu)(

3、Lipid rafts)以及一種與鞘脂類代謝密切相關(guān)的酸性鞘磷脂酶(ASM)具有密切的關(guān)系。配體誘導(dǎo)的受體聚簇往往是膜受體及其下游信號通路激活的基礎(chǔ)，它的發(fā)生遵循如下機(jī)制：受體與配體結(jié)合，使胞內(nèi)ASM激活并轉(zhuǎn)位至胞膜上，水解脂筏中的鞘磷脂產(chǎn)生神經(jīng)酰胺，導(dǎo)致脂筏結(jié)構(gòu)的融合，最終使脂筏上相應(yīng)的受體產(chǎn)生聚簇現(xiàn)象。該機(jī)制的闡明為研究各種非配體因素如何作用于靶細(xì)胞膜受體的機(jī)制提供了新的思路。大量研究表明多種非配體的刺激因素能誘導(dǎo)細(xì)胞特定的受體產(chǎn)生

4、聚簇，這其中就包括與工頻磁場同為非電離輻射的紫外線UV-C，以及電離輻射γ射線等物理刺激因素，并且這些聚簇現(xiàn)象的產(chǎn)生與配體誘導(dǎo)的受體聚簇遵循了相似的機(jī)制。進(jìn)一步的研究則表明，脂筏結(jié)構(gòu)，特別是其中主要的結(jié)構(gòu)成分鞘脂類物質(zhì)在其中發(fā)揮了重要的作用。作為細(xì)胞膜的基本組成成分，鞘脂類物質(zhì)由一分子長鏈脂肪酸、一分子鞘氨醇或其衍生物及一分子極性頭醇而組成，其種類包括鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷脂等。目前，隨著對細(xì)胞膜信號通路研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)鞘脂類物

5、質(zhì)在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多方面也同樣扮演著重要的角色，研究人員也不再單純地認(rèn)為它們僅僅作為細(xì)胞的結(jié)構(gòu)組分，在揭示受體聚簇及其后續(xù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制研究中通常受到格外的重視。 為了解工頻磁場誘導(dǎo)的細(xì)胞受體聚簇是否遵循相同的機(jī)制，本研究論文以強(qiáng)度為0.4 mT的工頻磁場輻照處理人羊膜(FL)細(xì)胞，利用激光共聚焦顯微鏡免疫熒光技術(shù)較系統(tǒng)地分析細(xì)胞膜脂筏結(jié)構(gòu)與受體聚簇以及酸性鞘磷脂酶之間的相互關(guān)系，并首次引入脂類組學(xué)(Lipidomies)的高

6、通量技術(shù)研究工頻磁場對FL細(xì)胞鞘脂類代謝的影響。 觀察脂筏結(jié)構(gòu)在工頻磁場誘導(dǎo)FL細(xì)胞受體聚簇現(xiàn)象中的作用本部分研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察，同時引入脂筏結(jié)構(gòu)的抑制劑——制酶菌素(Nystatin)以研究脂筏結(jié)構(gòu)與工頻磁場誘導(dǎo)的細(xì)胞膜受體聚簇的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為Nystatin預(yù)處理組和非預(yù)處理組，各組又分別設(shè)假輻照組，DMSO溶劑對照組，50 Hz 0.4 mT磁場輻照組和表皮生長因子(EGF)陽性對照組，輻

7、照時間為15 min。其中預(yù)處理組在各種因素處理前先以60 μg/ml的Nystatin處理1h。結(jié)果顯示FL細(xì)胞經(jīng)表皮生長因子EGF和0.4 mT工頻磁場輻照處理15 min后均能觀察到較為明顯的EGF受體聚簇現(xiàn)象，圍繞細(xì)胞表面呈明亮的綠色光點(diǎn)，或形成光帶；而假輻照組與DMSO溶劑對照組中FITC綠色熒光標(biāo)記的EGF受體呈散在均勻分布，無明顯的聚簇現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過Nystatin預(yù)處理1h后，脂筏結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞受體聚簇現(xiàn)象均消失或

8、有所減弱。表明0.4 mT工頻磁場誘導(dǎo)的FL細(xì)胞受體聚簇與脂筏結(jié)構(gòu)具有密切的相關(guān)性。觀察酸性鞘磷脂酶ASM在工頻磁場作用下的轉(zhuǎn)位并與脂筏結(jié)構(gòu)共定位現(xiàn)象本部分研究同樣采用免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察方法，將細(xì)胞分為假輻照組，50Hz 0.4 mT；磁場輻照組和EGF陽性對照組，輻照時間為15min，結(jié)果顯示陽性對照組和磁場輻照組中Cy3標(biāo)記的ASM和FITC標(biāo)記的脂筏結(jié)構(gòu)在細(xì)胞膜表面形成特定的富集區(qū)域，并且產(chǎn)生共定位現(xiàn)象，而在

9、假輻照組中基本處于均勻分布狀態(tài)。經(jīng)細(xì)胞計數(shù)，采用Student's T檢驗(yàn)顯示輻照組與假輻照組之間差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。表明0.4 mT工頻磁場可以誘導(dǎo)FL細(xì)胞ASM發(fā)生轉(zhuǎn)位，并與脂筏結(jié)構(gòu)共定位。 工頻磁場輻照對FL細(xì)胞鞘脂類代謝的影響本部分研究應(yīng)用脂類組學(xué)高通量質(zhì)譜分析的方法對工頻磁場作用下FL細(xì)胞鞘脂類代謝的影響進(jìn)行探索。FL細(xì)胞經(jīng)0.4 mT工頻磁場分別輻照5，15和30 min后與假輻照組細(xì)胞一同收集，提取細(xì)胞鞘脂樣品，

10、采用基質(zhì)輔助激光解離——飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)分析細(xì)胞內(nèi)鞘脂類物質(zhì)含量的改變。結(jié)果顯示:0.4 mT工頻磁場作用下出現(xiàn)質(zhì)荷比m／z 704的峰值，顯示有新的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生，代表鞘磷脂的m／z 727的峰值在磁場處理30 min后消失。經(jīng)0.4 mT工頻磁場分別輻照15 min和30 min后還出現(xiàn)一類鞘糖脂物質(zhì)(CMH)。進(jìn)一步對所有峰值進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)代表神經(jīng)酰胺的m／z 509，m／z 611以及m／z 705

11、三個的質(zhì)譜峰在經(jīng)磁場輻照后表達(dá)量上升，其中，m／z 705在各輻照時間下與假輻照組相比差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。m／z 509與m／z611分別在15 min、30 min和5 min、30 min與假輻照比差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。代表鞘磷脂(sphingomyline，SM)的質(zhì)譜峰在表達(dá)量的變化上不具規(guī)律性。該部分結(jié)果顯示工頻磁場作用下可部分增加神經(jīng)酰胺的生成。 結(jié)論： 基于本研究條件下所獲得的結(jié)果，得出以下結(jié)論：