mTOR介導(dǎo)EAAT3促進豬腸上皮細胞增殖和氨基酸轉(zhuǎn)運的機制.pdf

1、EAAT3（excitatory amino acid transporter3）是腸道上皮細胞（IEC）主要的酸性氨基酸（包括谷氨酸和天冬氨酸）轉(zhuǎn)運載體。為了研究EAAT3對豬腸上皮細胞系IPEC-J2（porcine jejunal epithelial cell line）細胞增殖和氨基酸轉(zhuǎn)運的影響，本試驗采用PCR擴增技術(shù)，克隆得到長白豬EAAT3 cDNA序列并構(gòu)建過表達載體，獲得 EAAT3過表達的IPEC-J2穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。

2、在此基礎(chǔ)上，設(shè)計并合成EAAT3 RNA干擾序列，對IPEC-J2細胞中的EAAT3進行RNA干擾。利用全自動氨基酸分析儀檢測了EAAT3對游離氨基酸轉(zhuǎn)運的影響；應(yīng)用MTT和細胞計數(shù)檢測了EAAT3對IPEC-J2細胞增殖的影響；采用real-time PCR和Westernblot技術(shù)，分析EAAT3對mTOR信號通路關(guān)鍵蛋白和谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運載體xCT表達水平的影響。為開展谷氨酸感應(yīng)轉(zhuǎn)運的研究奠定基礎(chǔ)。
　　試驗結(jié)果如下：<

3、br>　?。?）豬EAAT3 cDNA克隆及EAAT3過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的獲取。同源性克隆得到長度為1575 bp的豬EAAT3cDNA片段。構(gòu)建過表達載體EAAT3-pcDNA3.1+，篩選獲得 EAAT3過表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。細胞免疫熒光技術(shù)、real-time PCR和Western blot鑒定EAAT3成功過表達。
　?。?）EAAT3在IPEC-J2細胞中有效RNA干擾的獲取。根據(jù)克隆得到的EAAT3完整CDS序列設(shè)計3對

4、干擾序列，real-time PCR和Western blot鑒定EAAT3RNA干擾情況，獲取最佳干擾序列siRNA-003的最佳干擾時間點為48 h。
　?。?）EAAT3對IPEC-J2細胞氨基酸轉(zhuǎn)運和細胞增殖的影響。EAAT3在調(diào)控酸性氨基酸轉(zhuǎn)運的同時過表達后可以顯著促進胱氨酸的轉(zhuǎn)運并且RNA干擾后可以顯著抑制胱氨酸的轉(zhuǎn)運。MTT和細胞計數(shù)的結(jié)果顯示，EAAT3過表達組的細胞增殖能力顯著高于對照組。
　?。?）EAA

5、T3對mTOR信號通路關(guān)鍵蛋白的影響。EAAT3過表達后可以顯著上調(diào) mTOR信號通路關(guān)鍵蛋白的表達水平；EAAT3 RNA干擾后可以顯著下調(diào)mTOR信號通路關(guān)鍵蛋白的表達水平。
　?。?）EAAT3對ATF4/xCT途徑的影響。EAAT3過表達后可以顯著上調(diào)xCT及其轉(zhuǎn)錄因子ATF4的表達水平；EAAT3 RNA干擾后可以顯著下調(diào)xCT及其轉(zhuǎn)錄因子ATF4的表達水平。
　　結(jié)論：
　?。?）豬EAAT3可能通過轉(zhuǎn)運谷