Slingshot介導(dǎo)的Cofilin活化在缺氧腸上皮細(xì)胞屏障功能損害中的作用與機制研究.pdf

1、長期以來，腸道被認(rèn)為是嚴(yán)重?zé)齽?chuàng)傷等外科應(yīng)激的中心器官。燒傷后由于屏障功能損害所引起的機體病理生理紊亂已得到廣泛認(rèn)可，但其具體機制尚未完全清楚。本課題組既往研究表明，嚴(yán)重?zé)齻蛉毖毖鯐r腸上皮屏障功能損害與細(xì)胞緊密連接(Tight junction，TJ)相關(guān)蛋白以及F-肌動蛋白(F-actin)等有關(guān)，但分子機制仍不清楚。絲切蛋白(Cofilin)是一種重要的肌動蛋白(Actin)結(jié)合蛋白，在細(xì)胞骨架肌動蛋白的聚合與解聚動態(tài)平衡的調(diào)控中

2、具有至關(guān)重要的作用，而Cofilin活性又直接受到其上游信號分子Slingshot(SSH)的調(diào)控。研究表明，SSH家族蛋白引起Cofilin去磷酸化而激活Cofilin，從而調(diào)控細(xì)胞骨架肌動蛋白聚合與解聚的動態(tài)平衡。
　　嚴(yán)重?zé)齻缙趽p害的實質(zhì)其實就是缺血缺氧性損害。因此，我們假設(shè)嚴(yán)重?zé)齻缙诘娜毖毖跬ㄟ^誘導(dǎo)SSH表達而引起腸上皮細(xì)胞Cofilin活化，導(dǎo)致細(xì)胞骨架肌動蛋白的聚合與解聚平衡失調(diào)，進一步引起緊密連接蛋白的變化，從

3、而導(dǎo)致腸上皮屏障功能損害。
　　目的：
　　本課題擬通過體外實驗建立單層腸上皮細(xì)胞模型，研究缺氧條件下腸上皮細(xì)胞SSH/Cofilin/F-actin通路的變化及其在嚴(yán)重?zé)齻缙谀c上皮屏障功能損害中的作用，進而闡明其分子機制。
　　方法：
　　1.常規(guī)培養(yǎng)人腸上皮細(xì)胞株Caco-2，將Caco-2細(xì)胞種植于Transwell聚碳酸酯膜，建立單層腸上皮細(xì)胞模型。將單層Caco-2細(xì)胞在1％ O2環(huán)境條件下進行缺氧處

4、理，缺氧時間分別為0、1、2、6、12及24h;另將單層Caco-2細(xì)胞分別用Jasplakinolide與LatA進行處理，處理時間分別為0、1、2、6、12及24h。
　　2.采用生物電阻測定儀檢測跨上皮細(xì)胞電阻(TER)，以反映單層腸上皮細(xì)胞屏障功能的完整性;用FITC-dextran示蹤法檢測單層腸上皮細(xì)胞通透性的變化。
　　3.采用熒光法檢測單層腸上皮細(xì)胞F-actin的分布以及F-actin/G-actin含量比

5、值的變化。
　　4.用間接免疫熒光法檢測單層腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1及Occludin分布的變化，并用Western blot法檢測單層腸上皮細(xì)胞ZO-1、Occludin及Claudin-1蛋白表達的變化。
　　5.采用Western blot法分別檢測單層腸上皮細(xì)胞Cofilin、p-cofilin、SSH-1、SSH-2及SSH-3蛋白表達的變化。
　　結(jié)果：
　　1.缺氧引起單層腸上皮細(xì)胞TER明顯

6、下降。
　　2.缺氧后單層腸上皮細(xì)胞纖維狀肌動蛋白形態(tài)分布明顯改變，F(xiàn)-actin/G-actin含量比值明顯降低。
　　3.缺氧單層腸上皮細(xì)胞Cofilin蛋白表達在各時相點均無明顯變化，而磷酸化cofilin蛋白表達顯著降低。
　　4.缺氧引起單層腸上皮細(xì)胞ZO-1、Occludin以及Claudin-1蛋白表達明顯降低，并引起ZO-1與Occludin分布明顯改變。
　　5.缺氧對單層腸上皮細(xì)胞Slings

7、hot-1、Slingshot-3蛋白表達無明顯影響，但引起Slingshot-2蛋白表達明顯升高。
　　6.Jasplakinolide和LatA均可引起單層腸上皮細(xì)胞TER明顯下降，通透性顯著增加。
　　7.Jasplakinolide和LatA均可引起單層腸上皮細(xì)胞ZO-1與Occludin蛋白表達明顯降低，并引起ZO-1與Occludin分布明顯改變。
　　8.Jasplakinolide引起單層腸上皮細(xì)胞F-

8、actin/G-actin比值明顯升高，尤其在24h升高顯著;而LatA則引起單層腸上皮細(xì)胞F-actin/G-actin比值在24h有較明顯的降低。
　　9.Jasplakinolide和LatA處理后，單層腸上皮細(xì)胞Cofilin蛋白表達在各時相點均無明顯變化，而p-cofilin蛋白表達顯著降低。
　　結(jié)論：
　　缺氧后單層腸上皮細(xì)胞屏障功能損害明顯，其分子機制可能是缺氧通過誘導(dǎo)Slingshot-2蛋白表達，激