復(fù)方血栓通過糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的干預(yù)研究.pdf

1、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabeticretinopathy,DR)是糖尿病(diabetesmellitusDM)最為常見和嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是成人盲的主要致盲性眼病之一。DR病理改變主要有毛細血管周細胞選擇性凋亡、微血管基底膜增厚、內(nèi)皮細胞增生、微動脈瘤形成、以及新生血管形成等一系列改變。目前具體的發(fā)生機理尚未完全明確，主要的因素包括高血糖狀態(tài)、糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的堆積、多元醇－肌醇通路代謝異常、活性氧(ROS)損傷、甘

2、油二脂－蛋白激酶C(PKC)系統(tǒng)的活化、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的作用、血流緩慢粘稠、無灌注區(qū)形成等。由于視網(wǎng)膜激光光凝和玻璃體手術(shù)只能挽救一部分的視網(wǎng)膜功能，如何利用藥物防治DR的發(fā)生發(fā)展就顯得非常重要。AGEs抑制劑、PKC抑制劑、VEGF抑制劑、改善微循環(huán)藥物都是目前研究的熱點，但大部分臨床研究效果不明顯。中醫(yī)中藥在視網(wǎng)膜血管性疾病的治療上有著豐富的臨床積累，對DR的防治有一定的效果。 復(fù)方血栓通膠囊是由三七、丹參、玄

3、參、黃芪組成的純中藥制劑，有改善微循環(huán)、清除自由基、調(diào)節(jié)凝血狀態(tài)、改善血液流變學(xué)狀態(tài)等效果。臨床觀察認為該藥能有效地防治糖尿病性視網(wǎng)膜病變，在增殖期糖尿病性視網(wǎng)膜病變手術(shù)治療后也有輔助功能，但相關(guān)的實驗研究尚未見諸報道。 本研究就復(fù)方血栓通對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的防治效果進行研究，具體如下： 目的：探討復(fù)方血栓通對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的干預(yù)效果，并研究其劑量一療效的關(guān)系。 方法：STZ(鏈脲佐菌素)誘導(dǎo)糖尿病大鼠

4、成功后，取55只糖尿病大鼠隨機分成5組，并取9只正常雄性Wistar大鼠設(shè)為正常對照組： N組：正常大鼠組；DM組：糖尿病大鼠非治療組；FXST-H組：糖尿病大鼠，接受復(fù)方血栓通高劑量1800mg/(kg·day)治療；FXST-M組：糖尿病大鼠，接受復(fù)方血栓通中劑量900mg/(kg·day)治療；FXST-L組：糖尿病大鼠，接受復(fù)方血栓通低劑量450mg/(kg·day)治療；DB組：糖尿病大鼠，接受羥苯磺酸鈣300mg/(

5、kg·day)治療。正常大鼠組n=9；其余各組動物數(shù)均為n=11。 實驗進行到第20周的時候，進行如下處理：(1)視網(wǎng)膜消化鋪片研究：每組取8只動物，麻醉后取其右眼球進行視網(wǎng)膜消化鋪片，顯微鏡下觀察微血管數(shù)目，計算周細胞/內(nèi)皮細胞比值，測量毛細血管相對面積。 (2)石蠟切片HE染色及免疫組化檢查VEGF表達：上述每組8只大鼠的左眼固定后常規(guī)石蠟切片，行HE染色觀察常規(guī)病理改變，并做SABC法免疫組化檢測VEGF表達情況，

6、高倍鏡下觀察陽性表達情況并計數(shù)。 (3)透射電鏡研究：每組取1只大鼠，麻醉后取其右眼視網(wǎng)膜行透射電鏡檢查，觀察視網(wǎng)膜各層變化，比較各組視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)改變。 (4)所有結(jié)果于SPSS統(tǒng)計軟件下進行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果：(1)消化鋪片結(jié)果：N組：微血管疏松，毛細血管管徑均勻一致，行走規(guī)則，可見極少數(shù)無細胞毛細血管，未見周細胞鬼影。微血管密度(19.0±3.3)/HPD(HPD，高倍視野直徑)，血管相對面積34.38±4

7、.14％，P/E比值(周細胞/內(nèi)皮細胞比值)0.3750±0.02915。 DM組：與N組比較，視網(wǎng)膜微血管網(wǎng)明顯變密，血管迂曲，走行紊亂；管徑大小不一，出現(xiàn)節(jié)段性膨大，部分管腔狹窄；可見較多無細胞毛細血管、周細胞鬼影等。微血管密度為(24.4±2.4)/HPD，血管相對面積43.76±2.27％，與N組比較明顯增加；P/E比值為0.2802±0.02001，與N組比較有所下降。以上三個指標(biāo)與N組對應(yīng)指標(biāo)相比差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(

8、P＜0.05)。 FXST-H組：視網(wǎng)膜微血管網(wǎng)輕度密集，血管走行基本規(guī)則，管徑相對一致，可見部分節(jié)段性膨大，無細胞毛細血管、周細胞鬼影等較DM組減少。與DM組相比，微血管密度(19.5±1.4)/HPD、血管相對面積34.88±3.14％有所下降，P/E比值0.3307±0.02949有所上升。三個指標(biāo)與DM組對應(yīng)指標(biāo)相比差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 FXST-M組：病變程度較DM組輕。與DM組相比，微血管密度

9、(20.7±2.8)/HPD、血管相對面積38.98±1.96％有所下降，P/E比值0.3414±0.01686有所上升。三個指標(biāo)與DM組對應(yīng)指標(biāo)相比差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 FXST-L組：病變程度較DM組輕。與DM組相比，微血管密度(20.6±3.2)/HPD、血管相對面積39.81±3.58％有所下降，P/E為0.3283±0.01262有所上升。三個指標(biāo)與DM組對應(yīng)指標(biāo)相比差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

10、 DB組：視網(wǎng)膜微血管改變較DM組明顯減輕。微血管網(wǎng)相對疏松，血管走行相對規(guī)則，管徑基本一致，可見部分節(jié)段性膨大，無細胞毛細血管、周細胞鬼影等較DM組減少。與DM組相比，微血管密度(20.3±2.6)/HPD、血管相對面積38.13±2.88％有所下降，P/E比值為0.3248±0.01942有所上升。三個指標(biāo)與DM組對應(yīng)指標(biāo)相比差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 (2)石蠟切片常規(guī)染色及免疫組化結(jié)果：N組：HE染色示

11、視網(wǎng)膜各層次清晰，細胞排列緊密，未見明顯異常。免疫組化示視網(wǎng)膜上少量VEGF陽性表達(5.5±1.0/HP)(HP,每高倍視野)。 DM組：HE染色示視網(wǎng)膜光感受器細胞層結(jié)構(gòu)破壞明顯，余各層結(jié)構(gòu)細胞水腫、間隙增寬，部分細胞出現(xiàn)異染色。免疫組化示視網(wǎng)膜VEGF陽性表達數(shù)目顯著增多(15.0±1.8/HP,P＜0.001)。 FXST-H組：HE染色示視網(wǎng)膜各層病變較DM組明顯減輕；免疫組化示視網(wǎng)膜VEGF陽性表達數(shù)目較DM

12、組降低(7.7±3.9/HP,P＜0.001)。 FXST-M組：HE染色示視網(wǎng)膜各層病變較DM組明顯減輕；免疫組化示視網(wǎng)膜VEGF陽性表達數(shù)目較DM組降低(7.7±2.0/HP,P＜0.001)。 FXST-L組：HE染色示視網(wǎng)膜各層病變較DM組明顯減輕；免疫組化示視網(wǎng)膜VEGF陽性表達數(shù)目較DM組降低(7.2±1.0/HP,P＜0.001)。 DB組：HE染色示視網(wǎng)膜各層病變較DM組明顯減輕；免疫組化示視網(wǎng)膜

13、VEGF陽性表達數(shù)目較DM組降低(6.3±0.9/HP,P＜0.001)。 (3)透射電鏡結(jié)果：N組：視網(wǎng)膜各層次細胞超微結(jié)構(gòu)良好，外節(jié)膜盤排列整齊，外核層細胞間隙無增寬，細胞器無腫脹，毛細血管管腔無閉塞，基底膜無增厚，電子密度均勻。 DM組：視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的改變：視桿細胞外節(jié)膜盤紊亂，部分出現(xiàn)溶解、斷裂；內(nèi)節(jié)線粒體腫脹，出現(xiàn)空泡變，外核層細胞水腫，間隙增寬，線粒體腫脹；部分毛細血管基底膜增厚，部分管腔閉塞。

14、 FXST-H、FXST-M、FXST-L組：該三組動物超微結(jié)構(gòu)變化程度均較DM組顯著減輕，視桿細胞排列較DM組整齊，內(nèi)節(jié)線粒體腫脹不明顯，外核層細胞形態(tài)良好，間隙正常。毛細血管管腔無閉塞，基底膜增厚不明顯。 DB組：視桿細胞外節(jié)膜盤、外核層、毛細血管管腔、基底膜等改變均較DM組明顯減輕，與FXST三個治療組基本相似。 結(jié)論：1.20周糖尿病大鼠，其視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)存在明顯的水腫、細胞結(jié)構(gòu)破壞現(xiàn)象；并有視網(wǎng)膜毛細血管迂

15、曲，密度增高，管腔大小不一，周細胞/內(nèi)皮細胞比值下降；同時可見VEGF過表達現(xiàn)象。 2.本研究中，復(fù)方血栓通能有效地改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜微血管改變，減輕視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)水腫、壞死情況，改善超微結(jié)構(gòu)改變，抑制VEGF過表達。 3.本研究中，復(fù)方血栓通三個劑量組效果大致相當(dāng)，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。 4.復(fù)方血栓通對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的干預(yù)效果與羥苯磺酸鈣相似。 5.有效地抑制VEGF過表達，可能是復(fù)方血栓通改善