激活TRPV1和PPARδ對高血壓鼠腎臟氧化應(yīng)激和鈉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2的作用.pdf

1、背景和目的:
　　高血壓是當(dāng)今最常見的慢性疾病之一,是心、腦、腎功能衰竭等重要疾病發(fā)生、發(fā)展的主要原因。心血管疾病是目前人類首要的死因,因此高血壓已經(jīng)成為威脅生命健康的重要衛(wèi)生問題,其防治策略的研究有突出的意義和價值。遺傳因素和環(huán)境因素的共同作用是高血壓發(fā)生發(fā)展的重要原因。多種飲食如高脂、鈉和鉀的含量等對高血壓的發(fā)生發(fā)展有重要影響。長期高鹽攝入會導(dǎo)致血壓升高,血壓的升高和攝鹽量有著明確的劑量?效應(yīng)關(guān)系,控制鹽的攝入可預(yù)防血壓升高并

2、能減少并發(fā)癥的發(fā)生。因此除限制過量鹽的攝入外,尋求更為簡單、有效地降低鹽相關(guān)的心血管疾病有突出價值。
　　瞬時受體電位通道香草醛類受體1型(Transient Receptor Potential Vanilloid1, TRPV1),是辣椒素高選擇性激動的受體,近年來其在心血管代謝疾病中的作用屢見報(bào)道。我們前期相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),膳食辣椒素通過激活動脈血管內(nèi)皮TRPV1,上調(diào)eNOS/NO通路和增加血管舒張功能,從而降低自發(fā)性高血壓大

3、鼠(Spontanously hypertensive rats,SHR)的血壓;在高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓小鼠中,膳食辣椒素通過激活TRPV1能夠改善血管內(nèi)皮的氧化應(yīng)激損害,減少氧化應(yīng)激產(chǎn)生的氧陰離子,增加一氧化氮(nitric oxide, NO)的活性和利用度,從而改善內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)功能障礙并降低血壓。研究表明,鹽與超氧陰離子(superoxide anion)的產(chǎn)生增加密切相關(guān),并能增強(qiáng)氧化應(yīng)激(oxidative stress

4、)反應(yīng)。NO具有血管保護(hù)作用,超氧陰離子淬滅NO是導(dǎo)致血管功能障礙和血壓升高的重要因素。因此,抗氧化劑治療能增加NO的生成,顯著改善高血壓患者的內(nèi)皮依賴的舒張功能,并且能降低高鹽攝入誘導(dǎo)的高血壓動物的血壓。此外,辣椒素還具有抗動脈粥樣硬化、增加尿鈉排泄、減輕體重、維持水鈉穩(wěn)態(tài)等一系列生物學(xué)作用。但許多研究只是體外研究和急性動物實(shí)驗(yàn)。腎臟含有豐富的毛細(xì)血管,那么激活TRPV1除了能改善血管氧化應(yīng)激損害與內(nèi)皮功能的作用外,膳食辣椒素是否能通

5、過調(diào)控TRPV1對高鹽環(huán)境因素造成的靶器官損害有保護(hù)作用值得進(jìn)一步研究。
　　醋酸脫氧皮質(zhì)酮(deoxycorticosterone acetate, DOCA)鹽型高血壓大鼠是以單腎切除術(shù)和高鹽為基礎(chǔ)建立的一種經(jīng)典的低腎素型高血壓模型,可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激,氧自由基增多,進(jìn)一步導(dǎo)致腎臟損害、腎臟纖維化。應(yīng)用辣椒素是否可以改善該類型高血壓動物的腎臟血管氧化應(yīng)激,從而保護(hù)腎臟功能,目前未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過構(gòu)建DOCA-鹽

6、型高血壓大鼠模型,在膳食中加入辣椒素對其進(jìn)行干預(yù),觀察辣椒素對DOCA-鹽型高血壓大鼠腎臟功能損害的保護(hù)作用,并對其抗氧化應(yīng)激機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　高鹽攝入可促進(jìn)高血壓的發(fā)展,肥胖患者易患高血壓。限制鹽的攝入量通常是抗高血壓推薦的治療方案之一,而鹽對葡萄糖和脂類代謝的影響還不清楚。血漿葡萄糖是從腎小球過濾,然后經(jīng)近端小管鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)體(SGLTs)重吸收,SGLT2是特異分布在腎臟近曲小管的一類葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體,并在腎臟糖重吸收

7、中發(fā)揮著主要作用。我們已經(jīng)報(bào)道,替米沙坦通過激活過氧化物酶體增殖物受體δ(PPARδ)預(yù)防體重增加和肥胖。脂聯(lián)素是由脂肪特異性分泌的脂肪因子,具有能降低血糖、改善胰島素抵抗、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抗動脈粥樣硬化等的作用,對糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展有一定的保護(hù)作用。脂肪PPARδ是否能通過相關(guān)脂肪因子影響血糖代謝以及參與相關(guān)代謝器官的調(diào)控,目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)以野生型、脂肪特異性PPARδ敲除小鼠等動物模型,通過長期高鹽干預(yù),觀察長期高鹽飲食下

8、脂肪PPARδ是否有改善小鼠血糖體重的作用,并觀察其與脂聯(lián)素和腎臟鈉糖轉(zhuǎn)運(yùn)體機(jī)制進(jìn)行初步研究。
　　材料與方法
　　實(shí)驗(yàn)分為2部分,第一部分以DOCA-鹽型高血壓大鼠為模型,觀察辣椒素對DOCA-鹽型高血壓大鼠腎臟功能損害的保護(hù)作用。
　　以10周齡250g左右的雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組,2組行左腎切除術(shù)和DOCA+鹽處理制造DOCA鹽型高血壓大鼠模型,1組為為假手術(shù)對照組。DOCA鹽型高血壓大鼠分為:普食組和辣椒素組

9、,動物整體干預(yù)時間為8周。
　　1.使用鼠尾測壓方法,測定高鹽狀態(tài)下普食和辣椒素長期干預(yù)后DOCA鹽型血壓大鼠鼠尾壓、心率變化情況;
　　2.使用大鼠體重檢測方法,測定高鹽狀態(tài)下普食和辣椒素長期干預(yù)后DOCA鹽型血壓大鼠體重變化情況;
　　3.收集各組大鼠干預(yù)8周時24-h尿量,使用全自動生化分析儀檢測尿標(biāo)本中蛋白、肌酐濃度;
　　4.各組干預(yù)結(jié)束后大鼠取材,取頸動脈血使用血漿生化儀檢測尿素和肌酐值,腎臟稱重計(jì)算

10、腎重/體重值,分離腎內(nèi)小動脈行熒光染色。
　　5.采用DHE、DAF-2DA熒光染色檢測大鼠腎內(nèi)小動脈的超氧陰離子、NO水平。
　　6.蛋白免疫印跡法檢測腎小動脈組織eNOS、p-eNOS的表達(dá)和TRPV1、UCP2的表達(dá)。
　　第二部分以野生型小鼠和脂肪特異性PPARδ敲除小鼠等動物模型,通過長期高鹽干預(yù),觀察長期高鹽飲食下脂肪PPARδ是否有改善小鼠血糖體重的作用。
　　6周齡雄性Wild type小鼠16只

11、和Fabp4-PPARδ-/-小鼠16只,隨機(jī)為普食組和高鹽組2組,分別用普通飼料(0.4％鹽)和高鹽飼料(8%鹽)喂養(yǎng)24周。
　　1.使用鼠尾測壓方法,測定普食和長期高鹽膳食下Wild type小鼠和Fabp4-PPARδ-/-小鼠鼠尾血壓、心率變化情況;
　　2.使用小鼠糖耐量檢測方法,測定普食和長期高鹽膳食下 Wild type小鼠和Fabp4-PPARδ-/-小鼠糖耐量變化情況;
　　3.收集各組小鼠干預(yù)24

12、周時24-h尿量,使用全自動生化分析儀檢測尿標(biāo)本中尿鈉、尿糖排泄量;
　　4.各組小鼠干預(yù)24周時進(jìn)行急性SGLT2功能試驗(yàn),測定各組小鼠性鈉糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2功能變化情況;
　　5.干預(yù)結(jié)束后小鼠取材,取頸動脈血用ELISA法行血漿脂聯(lián)素水平檢測,取腎皮質(zhì)和腎周脂肪做western-blot檢測。
　　6.蛋白免疫印跡法檢測腎周脂肪的 PPARδ、adiponectin、adipoR1和腎皮質(zhì)adiponectin、adip

13、oR1,SGLT2表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1. DOCA鹽型高血壓大鼠血壓、體重明顯高于假手術(shù)組。辣椒素干預(yù)能明顯降低DOCA鹽型高血壓大鼠血壓,辣椒素干預(yù)對DOCA鹽型高血壓大鼠的心率和體重并無影響。
　　2. DOCA鹽型高血壓大鼠的單腎質(zhì)量/體質(zhì)量、尿素氮、肌酐和尿蛋白均明顯高于假手術(shù)組,肌酐清除率降低。辣椒素明顯降低DOCA鹽型高血壓大鼠的單腎質(zhì)量/體質(zhì)量、尿素氮、肌酐和尿蛋白,升高肌酐清除率。
　　3.

14、 DOCA鹽型高血壓大鼠腎內(nèi)小動脈超氧陰離子水平明顯高于假手術(shù)組,而NO水平明顯低于假手術(shù)組。膳食辣椒素能明顯降低腎內(nèi)小動脈超氧陰離子水平和NO水平。
　　4. DOCA鹽型高血壓大鼠較假手術(shù)組腎內(nèi)小動脈TRPV1和p-eNOS蛋白表達(dá)下降。辣椒素能明顯增加DOCA鹽型高血壓大鼠腎內(nèi)小動脈TRPV1和p-eNOS蛋白表達(dá)。
　　5. DOCA鹽型高血壓大鼠腎內(nèi)小動脈解偶聯(lián)蛋白2( UCP2)和硝基酪氨酸(Nitrotyros

15、ine)蛋白表達(dá)增加相比較于假手術(shù)組。辣椒素能明顯增加DOCA鹽型高血壓大鼠腎內(nèi)小動脈UCP2蛋白表達(dá)和降低硝基酪氨酸蛋白表達(dá)。
　　6.長期高鹽飲食能降低 WT小鼠血糖和體重,可能與尿鈉排泄有關(guān),但對Fabp4-PPARδ-/-小鼠無效。
　　7.長期高鹽飲食能降低WT小鼠血糖和體重,可能通過PPARδ介導(dǎo)的SGLT2抑制途徑有關(guān)8.長期高鹽飲食能通過激動脂肪PPARδ表達(dá)增加脂聯(lián)素分泌從而抑制SGLT2表達(dá)。