來源于人退變椎間盤的三種干細(xì)胞與BM-MSCs生物學(xué)特性及組織工程應(yīng)用的比較研究.pdf

1、背景:
　　下腰痛(lowbackpain,LBP)是臨床常見疾病,是導(dǎo)致勞動(dòng)力喪失的主要原因之一,現(xiàn)在一致認(rèn)為椎間盤退變性疾病(Degenerativediscdisease,DDD)是引起LBP最常見的原因。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)80％的人一生當(dāng)中都曾發(fā)生過LBP,如此高的發(fā)病率給國家和社會帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　目前治療DDD的方法包括保守治療和手術(shù)治療。保守治療屬對癥治療,以減輕和緩解疼痛為目的,不能解決椎間盤(Interv

2、ertebraldisc,IVD)退變導(dǎo)致的生物學(xué)喪失問題,因此并不能從根本上解決疼痛的根源。手術(shù)治療主要包括髓核摘除術(shù)和脊柱融合術(shù)。手術(shù)治療旨在解除突出的椎間盤組織的機(jī)械壓迫作用,從而達(dá)到解除疼痛的目的,但其也因未能恢復(fù)IVD的生物學(xué)性能,遠(yuǎn)期效果并不好,且常因內(nèi)固定的使用而加速相鄰節(jié)段椎間盤退變,從而發(fā)生新的問題。
　　隨著科學(xué)技術(shù)的日新月異,特別是近年來逐漸出現(xiàn)了多種IVD移植和人工椎間盤置換技術(shù),這些技術(shù)一定程序上改善了臨

3、床治療的效果,但這些技術(shù)也沒有從根本上解決或者逆轉(zhuǎn)IVD的生物學(xué)功能,仍然存在許多并發(fā)癥和缺陷?，F(xiàn)在認(rèn)為理想的治療DDD的方法是既能緩解疼痛癥狀,又能恢復(fù)IVD的結(jié)構(gòu)和生理功能,遠(yuǎn)期效果好,復(fù)發(fā)率低。隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)特別是干細(xì)胞研究的迅速發(fā)展,基于干細(xì)胞的治療手段已成為治療DDD最有希望前途的手段之一。
　　近年來,應(yīng)用組織工程技術(shù)對退變椎間盤進(jìn)行再生和修復(fù)的研究取得了一些成績,尋求以提高所構(gòu)建的組織工程椎間盤的生物學(xué)活性為目的的新型

4、種子細(xì)胞來源成為一項(xiàng)重要的任務(wù)。當(dāng)前,多項(xiàng)研究證實(shí)人退變纖維環(huán)、髓核組織中存在具有多向分化潛能的干細(xì)胞。此外,在我們的前期工作中,課題組從人退變軟骨終板中亦分離出類似于MSC的干細(xì)胞,這些細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)可以向骨、軟骨、脂、肌方向分化,且體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出比BM-MSCs更強(qiáng)的成軟骨能力。本研究旨在前期研究的基礎(chǔ)上,從人退變椎間盤中分離、擴(kuò)增纖維環(huán)細(xì)胞、髓核細(xì)胞、軟骨終板細(xì)胞,經(jīng)瓊脂糖懸浮培養(yǎng)法篩選后,并探討纖維連接蛋白篩選的效能,所獲取的干

5、細(xì)胞克隆與來自同一個(gè)體的BM-MSCs進(jìn)行初步的細(xì)胞生物學(xué)特性比較,作為種子細(xì)胞分別構(gòu)建組織工程髓核,進(jìn)一步比較上述四種干細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的髓核再生和椎間盤的修復(fù)能力。
　　目的:
　　通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)對NPSCs、AFSCs、CESCs與BM-MSCs的生物學(xué)特性進(jìn)行檢測與比較,初步探討四種干細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、增殖活性、表面標(biāo)記物和體外向三系分化的能力以及作為組織工程種子細(xì)胞在組織工程應(yīng)用上的生物學(xué)特性差異,以期尋找一種新的、

6、可應(yīng)用于組織工程學(xué)的種子細(xì)胞,為組織工程椎間盤的構(gòu)建甚至臨床的應(yīng)用治療提供良好的種子細(xì)胞來源。
　　方法:
　　從因患腰椎間盤退變性疾病行椎間盤摘除植骨融合術(shù)中收集符合納入標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本。將手術(shù)中最先切除出來的AF組織經(jīng)副教授以上職稱經(jīng)驗(yàn)豐富的術(shù)者確認(rèn)后,收入AF標(biāo)本盒,隨后兩次切除組織予以舍棄,其后切除的標(biāo)本經(jīng)術(shù)者確認(rèn)為NP時(shí)裝NP標(biāo)本盒,刮除的CEP裝入CEP盒,植骨前取髂骨時(shí)接>5ml骨髓,以上標(biāo)本再在解剖顯微鏡下清理異物

7、雜質(zhì)如韌帶、肌肉及脂肪等,再次分離AF、NP及CEP,運(yùn)用機(jī)械-酶消化法獲取AF細(xì)胞、NP細(xì)胞和CEP細(xì)胞。BM-MSCs運(yùn)用Percoll液梯度分離法獲取。獲得的IVD來源的三種細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增至第2代時(shí),第2代細(xì)胞經(jīng)瓊脂糖懸浮培養(yǎng)法篩選,并初步探討Fibonectin差別粘附法的篩選效果,挑選取單細(xì)胞形成的克隆進(jìn)行體外擴(kuò)增,擴(kuò)增后的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測干細(xì)胞標(biāo)志物、多向分化能力,進(jìn)行干細(xì)胞的鑒定。同樣,經(jīng)誘導(dǎo)向骨、軟骨及脂三系分化的

8、不同干細(xì)胞,經(jīng)RT-PCR及組織學(xué)檢測分析,尋找不同干細(xì)胞向不同細(xì)胞系分化能力的差異性。將不同干細(xì)胞復(fù)合藻酸鹽體外構(gòu)建組織工程髓核,培養(yǎng)1、7、14及28天后進(jìn)行支架細(xì)胞增殖檢測、DNA和sGAG含量檢測,最后行SEM檢測,尋找差異性。另外所獲細(xì)胞經(jīng)CFDA-SE熒光染料標(biāo)記后植入纖維環(huán)穿刺抽髓核抽吸法制造的椎間盤退變動(dòng)物模型體內(nèi),于術(shù)后第1、3及6月后進(jìn)行MRI和X線檢測評估IVD的退變情況,并在第6月處死動(dòng)物,進(jìn)行目標(biāo)椎間盤的組織學(xué)

9、檢測評估。鑒于在前兩部分實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)四種不同干細(xì)胞中,CESCs具有最強(qiáng)的體外成骨及成軟骨能力,復(fù)合藻酸鹽構(gòu)建的組織工程髓核也具有良好的生物學(xué)性能。此外,已有大量研究發(fā)現(xiàn)BM-MSCs具有良好的體內(nèi)成骨效應(yīng),常常作為種子細(xì)胞來探討用于橫突間植骨融合的應(yīng)用研究,并顯示出了良好的應(yīng)用前景。因此,我們特將CESCs與BM-MSCs一起復(fù)合多孔羥基磷灰石植入新西蘭大白兔兩側(cè)橫突間,術(shù)后2月時(shí)間內(nèi)進(jìn)行X線、三維CT及microCT檢測及組織學(xué)評估

10、,探討兩種不同干細(xì)胞間的成骨效應(yīng)差異,分析和評估橫突間融合的融合效率差異。數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,定量結(jié)果采用配對T檢驗(yàn)、單因素方差分析和重復(fù)測量的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.來自同一個(gè)體的AFSCs、NPSCs、CESCs與BM-MSCs形態(tài)上類似,呈成纖維細(xì)胞樣外觀,但仍存在細(xì)小差別,AFSCs最細(xì)長,BM-MSCs最寬大,而CESCs尺寸最短,N

11、P居中;四種干/祖的體外增殖能力沒有顯著差異;在體外實(shí)驗(yàn)觀察中,經(jīng)PCR及半定量分析,CESCs成骨和成軟骨能力最強(qiáng),AFSCs和BM-MSCs居中,兩者沒有顯著差異,而NPSCs最弱;BM-MSCs成脂能力最強(qiáng),NPSCs次之,CESCs和AFSCs最弱;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,AFSCs和CESCs的CD105表面標(biāo)志物均值呈中強(qiáng)表達(dá),低于95%,而NPSCs略低于95%,四組干細(xì)胞的其它標(biāo)志物的表達(dá),滿足ISCT對間充質(zhì)干細(xì)胞的定義標(biāo)

12、準(zhǔn);四種干細(xì)胞體外構(gòu)建的組織工程髓核培養(yǎng)結(jié)果表明,CESCs與BM-MSCs組中合成和分泌的sGAG與DNA含量最高,NPSCs次之,AFSCs最弱;組織工程髓核中的細(xì)胞增殖無顯著差異;組織工程髓核的SEM結(jié)果表明,各干細(xì)胞皆與支架粘附較好,在28天后能分泌大量的ECM,其中CESCs最多,BM-MSCs次之,NPSCs居中,AFSCs最弱。
　　2.AFSCs、NPSCs、CESCs與BM-MSCs復(fù)合藻酸鹽植入椎間盤退變的動(dòng)物

13、模型體內(nèi),通過術(shù)后的檢測分析,CESCs-藻酸鹽復(fù)合物相對其余三組細(xì)胞具有最強(qiáng)的髓核再生和椎間盤修復(fù)能力,BM-MSCs-藻酸鹽和NPSCs-藻酸鹽居中,而AFSCs-藻酸鹽最弱。
　　3.CESCs與BM-MSCs與HA復(fù)合進(jìn)行兔腰椎橫突間植骨對比中,兩組干細(xì)胞復(fù)合HA皆能達(dá)到橫突融合,增強(qiáng)脊柱的穩(wěn)定性;CESCs相對BM-MSCs具有更強(qiáng)的體內(nèi)成骨能力;多孔羥基磷灰石在應(yīng)用于腰椎橫突間植骨融合實(shí)驗(yàn)時(shí),抗折性較差,需要加以改進(jìn),

14、以適應(yīng)一定的抗折性要求。
　　結(jié)論:
　　1.體外比較實(shí)驗(yàn)中,CESCs具有最強(qiáng)的成骨和成軟骨能力,AF和BM-MSCs居中,NPSC最弱。
　　2.CESCs顯示了用于構(gòu)建組織工程髓核的優(yōu)秀的生物學(xué)特性,在體內(nèi)或體外都可以作為一種具有優(yōu)越性能的種子細(xì)胞應(yīng)用于髓核組織工程領(lǐng)域,發(fā)揮干細(xì)胞的潛能。
　　3.初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相比較BM-MSCs,CESCs具有更強(qiáng)的體內(nèi)成骨能力。此外,CESCs能夠作為一種優(yōu)秀的種子