熒光HBV病毒體的形態(tài)學(xué)鑒定及在活細(xì)胞中的研究.pdf

1、目的：制備雙砷染料標(biāo)記的熒光乙型肝炎病毒（hepatits B virus,HBV）體，對(duì)其形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定分析，并動(dòng)態(tài)觀察HBV熒光體在活細(xì)胞中的生物學(xué)行為。
　　 方法：采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法，將已成功構(gòu)建帶有TC 標(biāo)簽的1.3倍乙型肝炎病毒基因組的載體質(zhì)粒（pTHBV1.3-mTC1）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞株中，該重組載體是通過PCR定點(diǎn)基因突變技術(shù)將一個(gè)能與雙砷熒光染料特異性結(jié)合的TC 標(biāo)簽（C-C-P-G-C-C)在基因水平

2、上插入到HBV 核心蛋白免疫主區(qū)c/el 位點(diǎn)。48h后通過間接免疫熒光檢測(cè)表面抗原在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與分布；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乙肝表面抗原(HBsAg)的表達(dá)；同時(shí)收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液，經(jīng)不連續(xù)蔗糖密度梯度離心進(jìn)行分離和純化后，加抗體孵育進(jìn)行免疫電鏡觀察分析，同等培養(yǎng)條件下HepG2細(xì)胞和2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液分別作為陰性和陽性對(duì)照?；罴?xì)胞研究中，我們應(yīng)用Oregon Green 488 Taxol 標(biāo)記

3、微管骨架后，在活細(xì)胞時(shí)差共聚焦顯微鏡下觀察熒光HBV 病毒體在宿主細(xì)胞中的運(yùn)輸過程。
　　 結(jié)果：間接免疫熒光結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染pTHBV1.3-mTC1組細(xì)胞中雙砷的紅色熒光強(qiáng)于轉(zhuǎn)染pTHBV1.3細(xì)胞組，呈典型的核漿型分布。電鏡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pTHBV1.3組細(xì)胞在48h 時(shí)可表達(dá)HBsAg 并可自行組裝成12nm 左右的球形顆粒后分泌至上清中，而陰性對(duì)照組和pTHBV1.3-mTC1組未見到與文獻(xiàn)報(bào)道一致的HBV 顆粒樣結(jié)構(gòu)。

4、活細(xì)胞時(shí)差共聚焦顯微鏡觀察顯示熒光HBV 顆粒感染HepG2細(xì)胞后約3h 熒光顆粒開始吸附并侵入胞內(nèi)，約5h 時(shí)在胞漿中富集而少數(shù)已到達(dá)核周，并可觀察到熒光HBV顆粒依賴于微管的運(yùn)動(dòng)。初步證實(shí)重組的HBV 熒光體同野生型HBV 一樣保留了抗原性和感染性。
　　 結(jié)論：TC嵌合型核心蛋白在轉(zhuǎn)染pTHBV1.3-mTC1細(xì)胞中能夠特異性的發(fā)出熒光，且TC標(biāo)簽的插入并不影響表面抗原及核心蛋白的表達(dá)。雙砷復(fù)合物這一新穎熒光標(biāo)記技術(shù)使得H