血流動(dòng)力學(xué)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化疾病及血管發(fā)育影響的機(jī)制研究.pdf

1、從建立血液循環(huán)開(kāi)始，血管系統(tǒng)就是一個(gè)以心臟為中心的力學(xué)系統(tǒng)，血流動(dòng)力學(xué)因素在血管生理病理過(guò)程中的作用尤為重要。雖然過(guò)去的很多年中對(duì)血流動(dòng)力學(xué)因素參與血管疾病以及血管發(fā)育生理病理過(guò)程有一定程度的研究和理解，但是由于研究方法手段和模式動(dòng)物的限制，血流動(dòng)力學(xué)對(duì)血管疾病和血管發(fā)育過(guò)程影響的在體研究還非常缺乏，血流動(dòng)力學(xué)參與調(diào)節(jié)血管病理生理過(guò)程的作用機(jī)制以及下游參與調(diào)控的信號(hào)通路等諸多方面的還知之甚少。
　　動(dòng)脈粥樣硬化(atheroscl

2、erosis, AS)好發(fā)于動(dòng)脈的彎曲、分叉及狹窄部位，這些AS好發(fā)的區(qū)域存在共同的血流動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，血流流場(chǎng)紊亂，會(huì)形成漩渦和旋擰流。局部的血流動(dòng)力學(xué)改變可能導(dǎo)致了AS局炤性的產(chǎn)生?；谝陨侠碚?，本論文第一部分研究主要目的就是闡明血流動(dòng)力學(xué)的改變對(duì)AS發(fā)生的局灶性的影響。
　　血管的發(fā)育在很大程度上是由遺傳控制，但是近年的研究發(fā)現(xiàn)血管的發(fā)育不僅僅是一個(gè)遺傳因素控制的過(guò)程，力學(xué)因素也是心血管系統(tǒng)發(fā)育所必需的。但到底哪些力學(xué)因素對(duì)血管

3、發(fā)育的過(guò)程產(chǎn)生如此重要的影響并沒(méi)有深入的研究，并且到目前為止血流動(dòng)力學(xué)對(duì)血管發(fā)育影響的力學(xué)信號(hào)通路也沒(méi)有完全闡明，血管內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)對(duì)血流機(jī)械性質(zhì)改變的分子機(jī)制，至今尚不完全清楚?；谝陨弦恍┥形赐耆鉀Q的科學(xué)問(wèn)題，本論文第二部分主要工作是研究血流動(dòng)力學(xué)改變對(duì)血管發(fā)育的影響極其分子機(jī)制，探討內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞收縮在力學(xué)機(jī)械信號(hào)傳導(dǎo)中的作用機(jī)制。
　　本論文主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下：
　?、僭谂咛ネ该鞯腇lk1: GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)中注射

4、紅色熒光標(biāo)記的低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL），通過(guò)激光共聚焦顯微鏡在體觀察 LDL在血管管腔中的分布，結(jié)果顯示血管系統(tǒng)中從血管壁面到血管中軸位置LDL是呈梯度分布的，LDL在血管壁面的濃度顯著高于血管管腔中的濃度，表明血液循環(huán)系統(tǒng)中存在脂質(zhì)濃度極化現(xiàn)象。并且我們還發(fā)現(xiàn)在血管分叉處的壁面LDL濃度顯著高于血管平直段壁面LDL濃度，猜測(cè)這個(gè)現(xiàn)象很可能是由于局部血流擾動(dòng)產(chǎn)生的。隨后采取數(shù)值模擬和實(shí)測(cè)的方

5、法模擬狹窄部位的流場(chǎng)，結(jié)果顯示在局部狹窄處血液流場(chǎng)紊亂、有二次流和漩渦的形成。同時(shí)利用兔子作為模式生物，通過(guò)血管外周套環(huán)的方法建立在體的頸總動(dòng)脈狹窄模型，分別給兔子飼喂高脂飼料和正常飼料，研究結(jié)果顯示在套環(huán)狹窄組才會(huì)有動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和病變的發(fā)生，在高脂組病變加劇。而在非手術(shù)組，不管是正常飼料還是高脂組都沒(méi)有病變的產(chǎn)生。這說(shuō)明動(dòng)脈粥樣硬化疾病局炤性的產(chǎn)生及其病變發(fā)生發(fā)展過(guò)程，局部血流動(dòng)力學(xué)的改變是關(guān)鍵因素。
　?、诮柚?xì)胞紅色熒

6、光標(biāo)記同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞綠色熒光標(biāo)記的雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)作為模式生物，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡在體觀察、全胚原位雜交以及熒光定量PCR等手段，研究血流動(dòng)力學(xué)力學(xué)改變對(duì)血管發(fā)育的影響。研究結(jié)果顯示在斑馬魚(yú)血管生成過(guò)程中，血流減小會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)血管發(fā)育畸形以及血管內(nèi)皮特異標(biāo)記基因 flk1、動(dòng)脈特異標(biāo)記基因ephrinB2和靜脈特異標(biāo)記基因 flt4的表達(dá)降低，并且flt4表達(dá)降低更加顯著，說(shuō)明血流動(dòng)力學(xué)改變會(huì)影響斑馬魚(yú)血管生成過(guò)程，血流對(duì)靜脈的發(fā)育影

7、響更大。
　?、弁ㄟ^(guò)MATLAB和Image J軟件對(duì)血液流動(dòng)視頻進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)在血流動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)血管發(fā)育過(guò)程中血流量、血液流速以及壁面剪切力發(fā)生顯著的改變，但是心率卻沒(méi)有顯著性的變化。然后我們對(duì)不同血流大小情況下各個(gè)力學(xué)因素與flk1相對(duì)表達(dá)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示隨著血流量、血液流速以及壁面剪切力的減少，flk1的相對(duì)表達(dá)量也是減少。血流量和血液流速與 flk1的相對(duì)表達(dá)量不是呈線性關(guān)系，而血流剪切力與 flk1的相對(duì)

8、表達(dá)量基本是呈線性關(guān)系的。說(shuō)明這三種血流動(dòng)力學(xué)因素都是參與了力學(xué)調(diào)節(jié)血管發(fā)育過(guò)程的。
　　④通過(guò)原位雜交和定量PCR實(shí)驗(yàn)研究，我們發(fā)現(xiàn)血流減小會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)中轉(zhuǎn)錄因子klf2a以及enos類似物nos2b的基因表達(dá)降低。于是接下來(lái)我們研究了klf2a和nos2b這兩個(gè)力學(xué)響應(yīng)因子參與力學(xué)調(diào)節(jié)血管發(fā)育這個(gè)過(guò)程的分子機(jī)理，單獨(dú)注射klf2a-MO會(huì)導(dǎo)致血管發(fā)育畸形和nos2b表達(dá)的下調(diào)，并且這個(gè)過(guò)程是可以通過(guò)共注射klf2a-mRNA進(jìn)

9、行回救。說(shuō)明klf2a參與血流動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)的血管發(fā)育過(guò)程，并且暗示nos2b也可能參與了該過(guò)程。
　　⑤通過(guò)平板流動(dòng)腔設(shè)備人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外加載剪切應(yīng)力，結(jié)果顯示剪切力可以促進(jìn)細(xì)胞收縮并且上調(diào)klf2和enos基因和蛋白表達(dá)。利用三種特異性的細(xì)胞收縮和松弛的藥物分別處理細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的收縮和松弛狀態(tài)可以調(diào)節(jié)klf2和enos基因和蛋白的表達(dá)，并且這個(gè)過(guò)程是通過(guò)F-actin聚合/解聚和myosin II來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　綜

10、上所述，我們的研究結(jié)果第一次在體的觀察和證實(shí)了血液循環(huán)系統(tǒng)中脂質(zhì)濃度極化現(xiàn)象的存在，闡明了局部血流動(dòng)力學(xué)改變導(dǎo)致AS局灶性的產(chǎn)生并且促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展。并且我們的研究工作第一次在體的并且詳細(xì)的分析了在血流動(dòng)力學(xué)對(duì)血管生成影響過(guò)程中各個(gè)血流動(dòng)力學(xué)因素與血管發(fā)育的關(guān)系，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了klf2a作為重要的力學(xué)響應(yīng)因子參與血流動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)血管發(fā)育的過(guò)程。最后，本文的研究工作還為剪切力調(diào)控相關(guān)響應(yīng)因子的表達(dá)提供新的信號(hào)通路：剪切力通過(guò)調(diào)節(jié)F-a