人外周血纖維細胞的分離、培養(yǎng)及其在真皮微血管內(nèi)皮細胞作用下的趨化運動研究.pdf

1、外周血纖維細胞（peripheral blood fibrocytes）是近年來發(fā)現(xiàn)的一個多分化潛能細胞，它具有成纖維細胞的特性，并被最新研究證實能分化為肌成纖維細胞與血管周細胞。外周血纖維細胞能夠在組織損傷后在炎癥期迅速遷移至創(chuàng)面局部，進而發(fā)揮它抗原呈遞、收縮創(chuàng)面、合成釋放多種細胞因子和細胞外基質(zhì)并促進創(chuàng)面新生血管形成等等一系列作用，因此可以說，PBFCs的定向遷移是其在創(chuàng)傷修復中發(fā)揮作用的重要基礎。而骨髓來源的PBFCs是受到哪些因

2、子或細胞的趨化而定向遷移到創(chuàng)傷部位的，關于這一問題目前尚無相關報道。此外，關于外周血纖維細胞的體外分離培養(yǎng)，目前常用的方法都需要免疫磁珠篩選來對PBFCs進行純化，此法費用高昂且獲得的目的細胞數(shù)量少，不利于臨床應用研究的開展。
　　實驗目的：
　　探索更為簡便易行的外周血纖維細胞體外培養(yǎng)方法、了解體外培養(yǎng)的PBFCs生物學特征及功能，研究體外共培養(yǎng)條件下人真皮微血管內(nèi)皮細胞對外周血纖維細胞有無趨化作用。
　　方法：

3、r>　　采用Ficoll密度梯度離心分離法分離成人外周血，所獲得的白細胞在一定條件要求下體外培養(yǎng)，觀察不同接種密度、換液時間、血清濃度等培養(yǎng)條件下對PBFCs生長分化的影響，采用流式細胞技術、細胞免疫熒光染色等對體外培養(yǎng)的細胞進行鑒定，在掃描電鏡下進一步觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，Transwell小室共培養(yǎng)初步探索人真皮微血管內(nèi)皮細胞對PBFCs有無趨化作用。
　　結(jié)果：
　　1．采用“密度梯度離心法”分離成人外周血得到的白膜層細胞中

4、含有大量淋巴細胞、單核細胞和少量粒細胞，在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下，這些細胞于兩周左右分化培養(yǎng)出血液來源的前體細胞——外周血纖維細胞。
　　2．多種因素均會對外周血纖維細胞的培養(yǎng)造成影響，經(jīng)過我們反復實驗，認為血液來源的取材、首次換液的時間、細胞的接種密度、血清濃度等均是細胞培養(yǎng)成敗與否的關鍵因素。我們認為選取年齡在20至45歲的健康志愿者采血，以pH值為7.2~7.3，含有20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在六孔培養(yǎng)板上按5×106/cm2

5、接種，4天后首次換液，之后每三天換液一次，是PBFCs培養(yǎng)的適宜條件，經(jīng)以上條件培養(yǎng)得到的PBFCs細胞純度可達80%以上，能夠滿足科研實驗的一般要求。
　　3．免疫熒光染色鑒定的結(jié)果顯示培養(yǎng)12天時CD34和COLⅠ均為強陽性表達，繼續(xù)培養(yǎng)至28天時，血液來源的細胞表面抗原 CD34發(fā)生明顯丟失，免疫熒光染色幾乎不能顯色，相反 COLⅠ持續(xù)表達陽性，顯示 PBFCs不斷向成纖維細胞分化的特性。
　　4．Transwell穿

6、膜實驗證實了人真皮微血管內(nèi)皮細胞對外周血纖維細胞的趨化作用，為進一步研究血管新生過程中 PBFCs的定向遷移及其機制打下基礎。
　　結(jié)論：
　　采用密度梯度離心法配合適當?shù)呐囵B(yǎng)條件，成人外周血中存在的前體細胞經(jīng)體外分離、培養(yǎng)可分化為外周血纖維細胞，并保持其生物學特性，建立了較為可靠、穩(wěn)定的分離培養(yǎng)方法。初步掌握了體外培養(yǎng)過程中 PBFCs的生物學特性和表性變化，在此基礎上，研究證實了人真皮微血管內(nèi)皮細胞對外周血纖維細胞的趨化