皮瓣真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞的提取及其低氧后處理模型的建立.pdf

1、【背景】：
　　人游離皮瓣移植越來越廣泛應(yīng)用于修復(fù)嚴(yán)重創(chuàng)傷和腫瘤等造成的皮膚軟組織缺損，目前游離皮瓣的存活率仍然只有95％。以往的研究認(rèn)為影響皮瓣存活的因素很多，其中皮瓣缺血再灌注損傷是影響皮瓣的存活的一個重要的因素。確保游離皮瓣完全存活，提高皮瓣存活率是整形醫(yī)生首要目標(biāo)。研究者們發(fā)現(xiàn)通過藥理學(xué)和機械的干預(yù)能夠減輕再灌注損傷，但是藥物干預(yù)在臨床上的運用仍然受到限制?！叭毖筇幚怼睘殚L期缺血后以及再灌注之前進(jìn)行的一系列的機械重復(fù)周期

2、短暫的再灌注和再阻斷血流循環(huán)。目前，缺血后處理的保護(hù)作用已經(jīng)在家兔、大鼠的游離皮瓣得到證實；但是還未有人的皮瓣相關(guān)的研究，并且后處理的保護(hù)作用研究機制并不清楚。本研究是想通過建立人皮瓣微血管內(nèi)皮細(xì)胞低氧后處理模型，模擬在體的缺血后處理，研究缺血后處理的保護(hù)作用，為具體的機制研究奠定基礎(chǔ)。
　　【目的】：
　　參考國內(nèi)外皮瓣真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞提取方法，采用酶消化加磁珠分選的方法提取人皮瓣微血管內(nèi)皮細(xì)胞。確定低氧后處理的最佳的缺

3、氧和復(fù)氧時間，建立低氧后處理模型。
　　【方法】：
　　采用酶消化聯(lián)合磁珠分選法得到人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HDMECs），體外培養(yǎng)傳至P5代，采用Ⅷ因子免疫熒光及CD309、CD34流式細(xì)胞學(xué)進(jìn)行鑒定；檢測乳酸脫氫酶（LDH）在隨缺氧時間含量的變化；Tunel法染色計算各組的細(xì)胞凋亡率；用Western Blot的方法檢測Bcl-2、Bax和Caspase-3以及活化Caspase-3的蛋白含量表達(dá)。
　　【結(jié)果】：<

4、br>　　1.細(xì)胞分離培養(yǎng)4d后，可見散在的細(xì)胞集落，周邊有成纖維狀細(xì)胞生長，細(xì)胞集落，生長7d后，可見細(xì)胞呈鋪路石樣排列；
　　2.經(jīng)第2次分選，可見細(xì)胞呈緊密排列的漩窩狀或同心圓狀外觀，呈鋪路石樣排列。第二次CD31磁珠分選后陽性率＞95%；
　　3.二次 CD31磁珠分選后流式細(xì)胞鑒定結(jié)果：CD309陽性率為(95.4±1.34)%；CD34陽性率為（42.5±3.23）%；
　　4.免疫熒光檢測上清液中LDH：

5、結(jié)果LDH隨著缺氧時間的增加而加，8h與0h、2h、4h、6h相比LDH含量顯著增加p<0.05，8h與12h差異性不顯著p>0.05；
　　5.Tunel和Western結(jié)果顯示2min*3s和5min*3s的缺氧后處理(hypoxic postconditioning，H-postC)能夠起到保護(hù)作用；
　　【結(jié)論】：
　　1.根據(jù)細(xì)胞的集落形態(tài)以及免疫熒光和流式的結(jié)果分析得出，消化酶加 CD31磁珠分選真皮微血管

6、內(nèi)皮細(xì)胞(HDECMs)的辦法穩(wěn)定可靠；
　　2.根據(jù)乳酸脫氫酶（LDH）隨缺氧時間變化的結(jié)果，確定最佳的缺氧時間；
　　3.通過Tunel凋亡染色檢測細(xì)胞凋亡比率；蛋白免疫印跡（WesternBlot,WB）檢測Bax、Bcl-2和活化的Caspase-3、Caspase-3蛋白含量的表達(dá)，建立了人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞的低氧后處理模型，其中2min*3s和5min*3s是最好的后處理循環(huán)次數(shù)和持續(xù)時間。
　　【討論】：

7、
　　本研究成功的采用 CD31磁珠分選的方法提取并培養(yǎng)了HDMECs，采用Ⅷ因子免疫熒光進(jìn)行鑒定，初步證實為HDMECs；同時采用CD34和CD309流式抗體檢測細(xì)胞的生物學(xué)特征，這樣能更方便我們在體外研究HDMECS的生理和病理生理特征。根據(jù)WB和Tunel結(jié)果分析我們同樣發(fā)現(xiàn)，單純低氧8h/復(fù)氧24h，活化的caspase-3/caspase-3、Bax/Bcl-2以及細(xì)胞凋亡的比例高于其他組。并且2min*3s和5min*