水蛭素調(diào)節(jié)MAPKs通路促進(jìn)大鼠缺血皮瓣血管生成及抗血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、第一章:水蛭素通過調(diào)節(jié)p38MAPK與ERK通路間的交匯作用促進(jìn)大鼠缺血皮瓣血管生成
　　背景：隨意皮瓣在整形外科或創(chuàng)傷外科常常被用于修復(fù)創(chuàng)傷、功能重建或改善外觀。當(dāng)其長寬比例過大，皮瓣遠(yuǎn)端將會有可能發(fā)生血運(yùn)循環(huán)障礙，最終可導(dǎo)致皮瓣部分壞死。前期研究發(fā)現(xiàn)局部注射水蛭素治療能通過有效的促進(jìn)缺血皮瓣組織中的微血管生成，從而增加皮瓣最終成活面積。但水蛭素是如何促進(jìn)皮瓣微血管生成的相關(guān)分子機(jī)制卻未能進(jìn)一步闡明。
　　目的：在這部分研

2、究中，將探討水蛭素是否同過調(diào)解血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）和血小板反應(yīng)蛋白1（TSP-1）與內(nèi)皮抑素（Endostatin）之間表達(dá)的平衡促進(jìn)皮瓣微循環(huán)的重建。此外，同時研究水蛭素促皮瓣微循環(huán)重建是否與調(diào)控絲裂原激活蛋白激酶類（MAPKs）通路激活有關(guān)。
　　方法：在每只SD大鼠的背部中線兩側(cè)分別構(gòu)建1個大小為7.5cm×1.5cm的缺血皮瓣模型。將皮瓣隨機(jī)分為水蛭素組和對照組，水蛭素組皮瓣在皮下注射2 ATU水蛭素，而對照組

3、則注射等量的生理鹽水。治療的時間為在術(shù)后即刻以及在術(shù)后第1、2和3天。術(shù)后第6天拍攝皮瓣的影像并計(jì)算皮瓣的成活面積和壞死面積。分別在術(shù)后0、1、2、4和6天提取皮瓣組織的總蛋白分進(jìn)行免疫印跡分析。同時還檢測了術(shù)后第4天和地6天皮瓣組織中的血管密度值（MVD）。
　　結(jié)果：術(shù)后的第6天，水蛭素組皮瓣成活率(90±5.8％)明顯高于對照組(62±7.1%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后第4天，對照組皮瓣的表皮層與真皮層開始

4、出現(xiàn)部分壞死，皮瓣組織較少觀察到微血管。而水蛭素治療組皮瓣可觀察到早期的血管新生現(xiàn)象且組織壞死明顯少于對照組。術(shù)后第4天，水蛭素組血管密度值明顯多于對照組；在術(shù)后第6天，水蛭素組血管密值度為35.90±6.76 per field，而對照組因?yàn)榇竺娣e的壞死，未能觀察到成功染色的血管。皮瓣在形成后凝血酶的表達(dá)在術(shù)后的6天里持續(xù)增高，水蛭素能減少術(shù)后第1、2天凝血酶的表達(dá)量。在兩組皮瓣中VEGF術(shù)后均呈現(xiàn)表達(dá)升高，但水蛭素組的VEGF表達(dá)明

5、顯高于對照組。在水蛭素組，endostatin的表達(dá)在術(shù)后第1、2和4天低于對照組。在水蛭素治療組皮瓣中，TSP-1的表達(dá)在術(shù)后1至6天均有明顯的降低。局部應(yīng)用水蛭素能減少缺血皮瓣組織中p38 MAPK的磷酸化水平，提升的ERK1/2磷酸化水平，凝血酶可逆轉(zhuǎn)水蛭素對這兩種蛋白激酶的反向調(diào)控作用。抑制皮瓣中p38 MAPK的磷酸化可減少凝血酶誘導(dǎo)的TSP-1表達(dá)，但對endostatin的表達(dá)無影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)注射了p38 MAPK抑制

6、劑3h后，可觀察到皮瓣組織ERK1/2激活水平明顯升高。但在水蛭素誘導(dǎo)的ERK1/2活性被ERK1/2抑制劑抑制后，p38 MAPK的磷酸化水平并未受到影響。這一結(jié)果提示在皮瓣缺血條件下，存在著一個p38 MAPK到 ERK1/2的單向通路交匯作用。PAR1抑制劑注射后能明顯減少p38 MAPK的磷酸化，而增加ERK1/2磷酸化的水平(p<0.01)。這一結(jié)果與水蛭素治療后觀測到的相似。在PAR1被拮抗的情況下，水蛭素并不能進(jìn)一步降低p

7、38 MAPK的磷酸化，但仍然可以升高ERK1/2的磷酸化水平。這一實(shí)驗(yàn)說明，ERK1/2的激活是部分來自對p38 MAPK的抑制，而一部分可能與水蛭素其他作用有關(guān)。
　　結(jié)論：研究發(fā)現(xiàn)，水蛭素的促血管生成作用不僅是通過促進(jìn)VEGF的生成，還可能包括減少血管生成抑制因子TSP-1和endostatin的釋放。p38 MAPK和ERK1/2之間的通路交匯作用存在于缺血皮瓣組織中，水蛭素通過拮抗凝血酶/PAR1相關(guān)通路來調(diào)控該交匯作用

8、，進(jìn)而調(diào)控血管生成或抑制因子的表達(dá)，影響皮瓣組織血管生成的過程。
　　第二章：缺氧條件下水蛭素對皮瓣血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用相關(guān)機(jī)制研究
　　背景：在前期研究中，將水蛭素直接應(yīng)用于活體實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)能有效的改善血運(yùn)障礙皮瓣的血液循環(huán)，并能促進(jìn)皮瓣組織內(nèi)血管增殖，但前期的研究未能進(jìn)一步的深入探討水蛭素對血管內(nèi)皮細(xì)胞(VECs)的影響。
　　目的：研究水蛭素對缺氧或凝血酶誘導(dǎo)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：應(yīng)用CD3

9、1免疫熒光定位血管內(nèi)皮細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用Tunel法檢測細(xì)胞的凋亡，以此計(jì)算皮瓣中血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率。從SD大鼠主動脈中分離并培養(yǎng)出大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)出來后，應(yīng)用CD31免疫熒光和流式細(xì)胞學(xué)鑒定血管內(nèi)皮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分為正常組對照組（Nor組）、缺氧對照組（Cont組）、凝血酶組（2 U/ml凝血酶，Tho組）、水蛭素組（2ATU/ml水蛭素，Hir組）、低濃度水蛭素凝血酶組（1ATU/ml水蛭素+2/ml U凝血酶，L

10、ow-T+H組）和高濃度水蛭素凝血酶組（2ATU/ml水蛭素+2/ml U，凝血酶High-H+T組）。在細(xì)胞經(jīng)受缺氧刺激后6小時，將細(xì)胞總蛋白提出，并檢測Bim、ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化水平。同時，應(yīng)用Tunel分析各組細(xì)胞的凋亡率。
　　結(jié)果：在缺血皮瓣組織中，對照組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率為87.24±8.34%，水蛭素組凋亡率為36.44±9.57%，兩組經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)培養(yǎng)基中含有2 U/ml凝血酶

11、時，細(xì)胞在缺氧條件下的凋亡率顯著升高(p<0.01)。應(yīng)用水蛭素對抗凝血酶后，可降低凝血酶誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。缺氧可造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的p38 MAPK磷酸化水平升高，若這種情況下培養(yǎng)基中還存在有凝血酶，那么凝血酶可使得血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK磷酸化水平進(jìn)一步升高。水蛭素可抑制凝血酶誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK磷酸化。在20μM的SB203580抑制p38 MAPK磷酸化的情況下添加2 U/ml凝血酶不能使得細(xì)胞凋亡增加。還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用S

12、B203580抑制p38 MAPK磷酸化后，ERK1/2的磷酸化水平與對照組（Cont組）相比得到提高，說明可能存在p38 MAPK和ERK1/2通路間交匯。水蛭素可降低凝血酶誘導(dǎo)的p38 MAPK磷酸化并促進(jìn)ERK1/2的激活水平。同時，觀察到在Low-T+H組Bim的磷酸化水平明顯低于凝血酶組（Tho組）。
　　結(jié)論：缺氧狀態(tài)下凝血酶可進(jìn)一步的刺激p38 MAPK磷酸化和抑制ERK1/2的磷酸化，增加大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。水蛭