人卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其對PDGF-BB刺激反應(yīng)的研究.pdf

1、背景與目的： 腫瘤血管新生離不開內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖及遷移。腫瘤組織新生血管內(nèi)皮細(xì)胞與正常組織血管內(nèi)皮細(xì)胞存在差異，但長期以來由于腫瘤源性微血管內(nèi)皮細(xì)胞(tumorderivedmicrovascularendothelialcell，TdMEC)較難分離培養(yǎng)，體外研究腫瘤血管新生多應(yīng)用正常組織來源的內(nèi)皮細(xì)胞。因此，分離和培養(yǎng)TdMEC在研究腫瘤血管生成機(jī)制及抗血管生成治療方面具有重要意義。血小板源性生長因子(platelet-

2、derivedgrowthfactor，PDGF)是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的肽類生長因子，它在組織修復(fù)、胚胎發(fā)育、免疫以及多種常見疾病中起著重要作用。它在體外對內(nèi)皮細(xì)胞具有趨化活性并能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，在體內(nèi)能促進(jìn)新生血管形成。卵巢癌中存在顯著的血管生成現(xiàn)象，是研究腫瘤血管生成的良好材料。本實(shí)驗(yàn)在分離純化人卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(ovariancarcinoma-derivedmicrovascularendothelialcell，OdME

3、C)并觀察其生物學(xué)特性的基礎(chǔ)上，以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)為對照，通過觀察PDGF-BB對OdMEC生長、PCNA和VEGF表達(dá)的影響，初步探討OdMEC與正常血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性及對血管生成因子刺激反應(yīng)性的差異，為研究卵巢癌血管生成機(jī)制和抗血管生成提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 取卵巢癌手術(shù)標(biāo)本，采用胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、dNaseⅠ聯(lián)合消化法及Pe

4、rcoll密度梯度離心沉降法分離培養(yǎng)人卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞。應(yīng)用光鏡、透射電鏡和免疫細(xì)胞化學(xué)等技術(shù)對獲得的細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。采用四甲基偶氮噻唑藍(lán)法(MTT)測定細(xì)胞生長曲線，觀察其生物學(xué)特性。在此基礎(chǔ)上，用PDGF-BB干預(yù)OdMEC和HUVEC，利用免疫細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR技術(shù)觀察刺激后細(xì)胞增殖、PCNA及VEGF表達(dá)的變化。 結(jié)果： 1.采用酶聯(lián)合消化法及Percoll密度梯度離心沉降法分離獲得純度較高(細(xì)胞純度＞8

5、5％)、可傳代的OdMEC。OdMEC的生長曲線顯示其滯留期較長，約3～4天，第4～7天為增殖高峰期。 2.OdMEC呈單層生長，互不重疊，呈現(xiàn)典型的“鋪路石樣”外觀；透射電鏡觀察到內(nèi)皮細(xì)胞特征性結(jié)構(gòu)W-P小體；FⅧ-RAg免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示胞質(zhì)及核周呈陽性反應(yīng)；形態(tài)學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果證明所獲的OdMEC具有內(nèi)皮細(xì)胞屬性。 3.利用不同濃度的PDGF-BB作用于OdMEC，觀察對其生長的影響。除5ng/ml外，其余濃

6、度對OdMEC的增殖均具有促進(jìn)作用，以20ng/ml作用最為顯著。在PDGF-BB20ng/ml作用下，OdMEC中PCNA的蛋白表達(dá)增強(qiáng)，但增強(qiáng)幅度弱于HUVEC；而VEGF蛋白及mRNA的表達(dá)增強(qiáng)的幅度高于HUVEC，說明OdMEC與HUVEC對PDGF-BB刺激的反應(yīng)性有顯著差異。 結(jié)論： 1.聯(lián)合酶消化法和Percoll密度梯度離心沉降法可以獲得較高純度的OdMEC(細(xì)胞純度＞85％)，可傳代培養(yǎng)。 2.