去細(xì)胞同種椎間盤：使退變椎間盤再生的天然生物材料.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 椎間盤脫細(xì)胞方法及效果評(píng)估
　　目的：評(píng)估多種新西蘭白兔椎間盤脫細(xì)胞方法其脫細(xì)胞效果以及新西蘭白兔椎間盤經(jīng)脫細(xì)胞后生物化學(xué)性質(zhì)里力學(xué)性質(zhì)。
　　方法：我們從4月齡新西蘭白兔中收集了45例胸椎及腰椎椎間盤標(biāo)本，用作體外實(shí)驗(yàn)。新西蘭白兔椎間盤周圍的肌肉組織及骨片被剔除干凈，切去軟骨終板保留髓核和纖維環(huán)，并在PBS中清洗以洗去多余的血液。處理后的椎間盤標(biāo)本立刻凍存于液氮中以備后用

2、。將標(biāo)本分為不作脫細(xì)胞處理的陰性對(duì)照組和行脫細(xì)胞組的A組以及B組。A組脫細(xì)胞方法:在37攝氏度水浴和液氮中反復(fù)溶凍5次，在2％TritonⅩ-100中浸泡24小時(shí)，在1％SDS溶液中浸泡24小時(shí)，后以200U/mlDNA酶處理2小時(shí)，處理后在PBS中清洗以洗去殘余試劑;B組脫細(xì)胞方法:在37攝氏度水浴和液氮中反復(fù)溶凍5次，在3％TritonⅩ-100中浸泡24小時(shí)，在2％SDS溶液中浸泡24小時(shí)，處理后在PBS中清洗以洗去殘余試劑.所有

3、標(biāo)本均以H&E和Alican藍(lán)染色，以免疫組織化學(xué)檢測(cè)椎間盤中Collagen typeⅠ，Collagen typeⅡ以及Aggrecan保存量，以DNeasy Blood&Kit試劑盒按生產(chǎn)商說(shuō)明書處理提取DNA，用NanoDrop8000檢測(cè)DNA含量，以吸光度比色法檢測(cè)HYP含量，根據(jù)以上結(jié)果確定適宜脫細(xì)胞方案，排除不適宜組，以凍干法使標(biāo)本脫水，以質(zhì)量變化推測(cè)含水量。以SEM及TEM檢測(cè)對(duì)照組及適宜脫細(xì)胞法組的微觀結(jié)構(gòu)。將脫細(xì)胞

4、材料分為纖維環(huán)及髓核和兩部分，適用電腦控制檢測(cè)裝置以檢測(cè)纖維環(huán)彈性模量，最大張力以及最大壓力，檢測(cè)髓核壓縮模量。
　　結(jié)果：A組和對(duì)照組在H&E和Alican藍(lán)染色，各項(xiàng)免疫組織化學(xué)結(jié)果中無(wú)明顯差異，B組則與對(duì)照組之間存在明顯差異;A組中HYP含量最高，對(duì)照組次之，B組中HYP含量最低，且三者存在明顯差異，A組方法為適宜椎間盤脫細(xì)胞方法。A組含水量明顯高于對(duì)照組，兩者SEM以及TEM結(jié)果無(wú)明顯差異;A組與對(duì)照組的彈性模量，壓力模量

5、，最大壓力以及最大延長(zhǎng)度均無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論：在37攝氏度水浴和液氮中反復(fù)溶凍5次，在2％TritonⅩ-100中浸泡24小時(shí)，在1％SDS溶液中浸泡24小時(shí)，后以200U/mlDNA酶處理2小時(shí)，處理后在PBS中清洗以洗去殘余試劑是新西蘭白兔適宜的椎間盤脫細(xì)胞方法。這種方法可以最大程度上的保留椎間盤原有的生物化學(xué)特點(diǎn)，微觀結(jié)構(gòu)以及力學(xué)特點(diǎn)。
　　第二部分 同種去細(xì)胞椎間盤材料安全性評(píng)估
　　目的：評(píng)估同種去細(xì)胞椎

6、間盤材料分別在體內(nèi)及體外的安全性。
　　方法：為評(píng)估同種去細(xì)胞椎間盤材料分別在體內(nèi)及體外的安全性，我們將新西蘭白兔椎間盤標(biāo)本分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組按第一部分中得出的適宜的椎間盤脫細(xì)胞方法進(jìn)行處理，對(duì)照組不予處理，分別植入新西蘭白兔脊柱兩側(cè)皮下，1月后去除實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，所有標(biāo)本均以HE染色觀察中性粒細(xì)胞分布，以免疫組織化學(xué)檢測(cè)MAC387及CD8水平觀察巨噬細(xì)胞及細(xì)胞毒T細(xì)胞水平。以梯度離心法收集新西蘭白兔MSC，將去細(xì)胞椎間

7、盤材料置于DMEM-HG中，放置于培養(yǎng)箱48小時(shí)，收集浸提液，將MSC培養(yǎng)于含F(xiàn)BS10％的DEME-HG(對(duì)照組)，25％浸提液+DMEM-HG，50％浸提液+DMEM-HG和100％浸提液中培養(yǎng)，以活死細(xì)胞染色觀察存活細(xì)胞，以CCK-8試劑盒及吸光度比色計(jì)觀察細(xì)胞活力。將MSC種植按第一部分方法脫細(xì)胞的新西蘭白兔椎間盤材料上，分別在第3天，第7天，第14天，第21天以活死細(xì)胞染色觀察存活細(xì)胞，以H&E染色觀測(cè)材料結(jié)構(gòu)以及MSC分布。

8、
　　結(jié)果：經(jīng)第一部分適宜脫細(xì)胞方法處理后的新西蘭白兔椎間盤材料在植入同種白兔皮下后未見(jiàn)明顯中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，細(xì)胞毒性T細(xì)胞浸潤(rùn);未經(jīng)第一部分適宜脫細(xì)胞方法處理后的新西蘭白兔椎間盤材料在植入同種白兔皮下后出現(xiàn)明顯中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，細(xì)胞毒性T細(xì)胞浸潤(rùn)并出現(xiàn)明顯血管生長(zhǎng);FBS10％的DEME-HG(對(duì)照組)，25％浸提液+DMEM-HG，50％浸提液+DMEM-HG和100％浸提液這四組在活細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)以及細(xì)胞活性無(wú)明顯差異。

9、MSC能在經(jīng)第一部分適宜脫細(xì)胞方法處理后的新西蘭白兔椎間盤材料生長(zhǎng)，擴(kuò)增以及遷移。
　　結(jié)論：經(jīng)第一部分適宜脫細(xì)胞方法處理后的新西蘭白兔椎間盤材料不會(huì)引起宿主產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，無(wú)體內(nèi)毒性。材料浸出液及材料對(duì)MSC無(wú)明顯毒性，不影響MSC增殖及遷移，不影響MSC細(xì)胞活力。
　　第三部分 驗(yàn)證脫細(xì)胞椎間盤材料的修復(fù)作用
　　目的：驗(yàn)證脫細(xì)胞椎間盤能在體外誘導(dǎo)MSC向椎間盤樣細(xì)胞分化，并且能夠在體內(nèi)試

10、驗(yàn)中有效阻止椎間盤的退變。
　　方法：通過(guò)掃描電鏡(SEM)觀察于體外植入脫細(xì)胞椎間盤材料后MSC的形態(tài)變化，并且用RT-PCR的方法測(cè)定MSC中椎間盤細(xì)胞相關(guān)基因（包括ColⅡ，ColⅠ，SOX-9，GPC3，AGN)的表達(dá)情況，來(lái)判斷MSC是否向椎間盤樣細(xì)胞分化。體外實(shí)驗(yàn)部分使用新西蘭大白兔，用針穿刺椎間盤制造椎間盤退變模型。L3-L4為陰性對(duì)照組，造模后注入生理鹽水;L4-L5為實(shí)驗(yàn)組，造模后植入脫細(xì)胞椎間盤顆粒;L5-L6

11、為空白對(duì)照組。然后分別觀察0、1、2、3月份的椎間盤含水量以及椎間盤高度。H&E染色、阿爾新藍(lán)染色觀察椎間盤微觀結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：SEM顯示植入MSC的脫細(xì)胞椎間盤內(nèi)可觀察到椎間盤樣細(xì)胞，且RT-PCR結(jié)果顯示植入后的MSC較平板培養(yǎng)的MSC椎間盤細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，如Ⅱ型膠原(ColⅡ)、蛋白多糖(AGN)、SOX-9和GPC3，而軟骨相關(guān)基因Ⅰ型膠原(ColⅠ)表達(dá)不增加。
　　體內(nèi)試驗(yàn)部分，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組組相比保