健康人糞便乳桿菌的分離、鑒定及遺傳多態(tài)性的初步研究.pdf

1、乳桿菌廣泛存在于人和動物腸道、植物表面等生境中。近年來，人們從乳桿菌的形態(tài)學、生理學、分類學、遺傳學、微生態(tài)學、生理功能及應用等諸多方面對其進行廣泛而深入的研究。由于乳桿菌具有很多益生功能，國內外已有大量含有乳桿菌的益生菌食品、保健品、藥品等產品問世，并受到消費者的普遍歡迎。為了更好的促進對乳桿菌的開發(fā)與利用，分離來源于人體腸道的乳桿菌更加具有實際應用價值，因為來源于人體的乳桿菌更加容易在人體腸道中定植。隨著分子生物學的飛速發(fā)展及生物物

2、理技術的應用，對微生物的鑒定方法已經從傳統(tǒng)的形態(tài)學分析、生理生化試驗發(fā)展到以PCR技術為基礎的各種分子生物學方法。這些方法鑒定微生物不需要繁瑣的微生物培養(yǎng)，通過設計的屬及種的特異性引物或探針，可以很容易的將微生物鑒定到種的水平，利用分子標記技術甚至可以將微生物鑒定到株的水平。單純的依靠傳統(tǒng)生理生化鑒定方法對微生物進行鑒定，得出的結果不夠可信，須與分子生物學方法相結合，才能對微生物進行準確的鑒定。本研究包括四方面內容： 1.乳桿菌

3、的分離純化以健康成人及學齡兒童的新鮮糞便為樣品，經過稀釋涂布于MRS培養(yǎng)基。通過形態(tài)學觀察及H2O2酶、糖發(fā)酵等生理生化試驗對所分得菌株進行初步鑒定，記錄形態(tài)學特性、生理生化鑒定結果及糖發(fā)酵鑒定結果。得到乳桿菌56株。 2.16SrDNA序列同源性分析方法鑒定乳桿菌16SrDNA序列同源性分析方法的具體步驟包括：乳桿菌基因組DNA的提取，PCR擴增、產物測序及同源性分析。將選擇的20株試驗菌株的測序結果與GenBank中該屬內菌

4、株的16SrDNA基因序列進行同源性分析，從而準確鑒定所分得菌株。最終得到嗜酸乳桿菌1株，卷曲乳桿菌1株，食竇魏斯氏菌1株，唾液乳桿菌唾液亞種1株，黏液乳桿菌2株，戊糖乳桿菌1株，發(fā)酵乳桿菌5株，植物乳桿菌8株。 3.變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術構建乳桿菌標準指紋圖譜采用PCR-DGGE技術對試驗菌株進行標準圖譜的構建，選擇基因組DNA的16SrDNA的V7-V8可變區(qū)序列進行PCR擴增，35～55％變形梯度凝膠電泳分離效果

5、較好，觀察指紋圖譜發(fā)現，試驗菌株大致分為7類。PCR-DGGE結果與鑒定結果不完全一致，說明DGGE方法也存在一定的局限性。 4.擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)技術初步研究乳桿菌的遺傳多態(tài)性從64對隨機引物中篩選出來的1對多態(tài)性較好的引物用來分析乳桿菌屬種間的遺傳多態(tài)性。反復試驗證明AFLP指紋圖譜重復性好，準確度高，所得的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖顯示出乳桿菌屬內相同種不同菌株之間的遺傳多態(tài)性，說明AFLP技術可作為乳桿菌同種不同菌