HER2靶向重組蛋白候選藥物e23sFv-Fdt-tBid的表達(dá)純化工藝研究.pdf

1、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HumanEpidermalGrowthFactorReceptor2，HER2）亦稱(chēng)ErbB2。研究發(fā)現(xiàn)，HER2分子過(guò)表達(dá)于胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多種癌組織中，并在這些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。目前，HER2分子已經(jīng)成為腫瘤治療領(lǐng)域的關(guān)鍵分子之一。研究人員一方面可以直接通過(guò)阻斷該分子介導(dǎo)的HER2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展；另一方面可以通過(guò)該分子介導(dǎo)相應(yīng)的抗腫瘤藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)

2、胞抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞，從而治療HER2陽(yáng)性腫瘤。
　　白喉毒素(DiphtheriaToxin，DT)是白喉?xiàng)U菌所產(chǎn)生的外毒素，該毒素由535個(gè)氨基酸組成，包括具有核糖體依賴(lài)的酶活性的A片段和由受體結(jié)合區(qū)與轉(zhuǎn)位區(qū)組成的B片段。DT的第187-196位氨基酸為轉(zhuǎn)位肽（稱(chēng)為Fdt），可在內(nèi)吞體被Furin蛋白酶酶切，并使外源蛋白轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)功能。
　　Bid蛋白是Bcl-2家族成員，分子量大小為22kD，該蛋白定

3、位于細(xì)胞質(zhì)中，可以被caspase8和GrB等多種蛋白酶切割，形成約為15kD的截短Bid（truncatedBid，tBid）片段，tBid從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至線(xiàn)粒體進(jìn)而釋放細(xì)胞色素c激活其它促凋亡分子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　前期研究中，我們構(gòu)建了由抗HER2分子的單鏈抗體e23sFv、轉(zhuǎn)位肽Fdt以及促凋亡蛋白tBid構(gòu)成的重組蛋白編碼基因，并將該基因?qū)胂鄳?yīng)的原核表達(dá)載體，通過(guò)大腸桿菌表達(dá)、蛋白復(fù)性及純化得到高純度的具有較好生物活性

4、的帶His標(biāo)簽e23sFv-Fdt-tBid重組蛋白。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明該重組蛋白e23sFv-Fdt-tBid可以特異性結(jié)合HER2分子并內(nèi)化入HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡；動(dòng)物體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)顯示該重組蛋白具有較好的抑瘤作用，并且與化療藥物聯(lián)合使用時(shí)效果更為顯著。重組蛋白e23sFv-Fdt-tBid對(duì)腫瘤良好的殺傷和抑制作用顯示該重組蛋白有望成為新的抗腫瘤候選藥物并進(jìn)入臨床應(yīng)用。
　　然而上述研究?jī)H限于重組抗腫瘤蛋白的實(shí)

5、驗(yàn)室小量制備，并未作為候選藥物進(jìn)行表達(dá)純化的工藝研究，同時(shí)，由于我們前期研究所獲得的重組蛋白e23sFv-Fdt-tBid均為帶His標(biāo)簽蛋白，不符合臨床藥物評(píng)審相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。為了使該藥物可以成為新的抗腫瘤候選藥物并進(jìn)入臨床應(yīng)用，我們?cè)诒狙芯恐邪凑张R床藥物評(píng)審的要求，以無(wú)標(biāo)簽蛋白生產(chǎn)及純化的方式進(jìn)行了藥用HER2陽(yáng)性腫瘤靶向治療促凋亡重組蛋白e23sFv-Fdt-tBid表達(dá)及純化工藝研究。
　　首先，我們使用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)重組蛋白質(zhì)

6、e23sFv-Fdt-tBid進(jìn)行了表達(dá)并對(duì)相關(guān)表達(dá)和純化工藝進(jìn)行了研究。我們將e23sFv-Fdt-tBid基因克隆入原核表達(dá)載體PET-22b中以轉(zhuǎn)化BL21（DE3）大腸桿菌，使用IPTG誘導(dǎo)后重組蛋白e23sFv-Fdt-tBid以包涵體形式表達(dá)，但表達(dá)量較低并存在截短蛋白表達(dá)；經(jīng)過(guò)表達(dá)條件及密碼子優(yōu)化后重組蛋白表達(dá)量得以提高，但重組蛋白質(zhì)仍以包涵體形式表達(dá)并存在截短蛋白表達(dá)；通過(guò)菌種50次傳代實(shí)驗(yàn)確定原核表達(dá)載體可以穩(wěn)定遺傳并

7、且可以穩(wěn)定表達(dá)重組蛋白質(zhì)；通過(guò)透析復(fù)性、稀釋復(fù)性及色譜復(fù)性等多種復(fù)性實(shí)驗(yàn)的嘗試發(fā)現(xiàn)該重組蛋白質(zhì)包涵體復(fù)性較為困難。
　　其次，我們使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)重組蛋白質(zhì)e23sFv-Fdt-tBid進(jìn)行了表達(dá)研究。我們將e23sFv-Fdt-tBid基因克隆入酵母表達(dá)載體pPICZαA中，使重組蛋白e23sFv-Fdt-tBid可以與載體中的α信號(hào)肽融合并進(jìn)行分泌表達(dá)。隨后將重組載體電轉(zhuǎn)入畢赤酵母細(xì)胞GS115和KM71H中并進(jìn)行陽(yáng)性克

8、隆的篩選。SDS-PAGE與WesternBlot分析均未檢測(cè)到重組蛋白e23sFv-Fdt-tBid在酵母細(xì)胞中的表達(dá)。
　　最后，我們還研究了重組蛋白e23sFv-Fdt-tBid在哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO中的表達(dá)。我們將e23sFv-Fdt-tBid基因克隆入pcDNA5/FRT載體，通過(guò)Flp-InTM定點(diǎn)整合系統(tǒng)使該基因整合到Flp-lnTMCHO宿主細(xì)胞基因組中的單拷貝位點(diǎn)上，以適當(dāng)濃度的潮霉素B篩選得到定點(diǎn)整合重組蛋白基因

9、的細(xì)胞克隆并使用基因組PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)重組蛋白的基因的整合及表達(dá)，結(jié)果表明CHO以分泌形式正確表達(dá)該重組蛋白并且不存在截短蛋白。
　　綜上所述，我們進(jìn)行了藥用重組蛋白e23sFv-Fdt-tBid的表達(dá)及純化工藝研究，確定了較為合適的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。該重組蛋白使用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量較高并且蛋白表達(dá)穩(wěn)定，但在大腸桿菌中該重組蛋白以包涵體形式表達(dá)，復(fù)性較為困難。使用畢赤酵母的α信號(hào)肽分泌表達(dá)e23sFv-Fdt