HER2靶向重組型Caspase-6融合蛋白對骨肉瘤細胞的促凋亡作用.pdf

1、骨肉瘤是一種最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于長骨的干骺端，一般累及12－25歲之間的患者。其突出的特點是轉(zhuǎn)移早，在臨床做出骨肉瘤診斷時，已有80％的患者發(fā)生了肺轉(zhuǎn)移。近25年中，骨肉瘤的治療有了長足的進展,近80％患者能保留病肢，且5年生存率由20％左右提高到近80％，但仍有半數(shù)以上的患者死于骨肉瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)。近十年來基因治療的興起、腫瘤的免疫治療和分子靶向治療為骨肉瘤的治療開辟了新的治療途徑。探索新的有效的治療方法已成為骨肉瘤研究的

2、重要方向。我們通過成功構建的HER2靶向重組型Caspase-6融合蛋白瞬時轉(zhuǎn)染骨肉瘤SOSP-9607細胞，體內(nèi)、外實驗檢測其促腫瘤凋亡的活性。
　　Caspase-6,又名為mch2，是Caspases家簇的一員，屬于效應Caspase分子。Caspase-6基因編碼一種34kDa、與CPP32(即Caspase-3)，Ich1/Nedd2和IL-1β等高度同源的蛋白，是哺乳動物細胞中介導凋亡的重要分子，也是哺乳動物細胞凋亡的

3、執(zhí)行分子之一。將Caspase-6基因的大小亞基進行重排，可以得到一個具有與天然活性Caspase-6分子晶體結構非常相似的分子，該分子具有天然Caspase-6的活性，可以作為CrmA和Bcl-2作用的下游分子，也能識別并切割PARP和laminA等底物，執(zhí)行細胞凋亡的功能。
　　HER2/neu分子是癌基因erbB2的編碼產(chǎn)物，其編碼基因定位于人染色體17q21，是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白，是表皮生長因子（EGF）受體

4、家族的成員之一。通常情況下，HER2/neu只在胎兒時期表達，到成年以后，僅有低水平表達于細胞表面。HER2/neu的過度表達存在于多種腫瘤組織，如轉(zhuǎn)移性乳腺癌（25％-30％）、炎癥性乳腺癌（50％）、轉(zhuǎn)移性導管癌（60-70％）、非小細胞肺癌（13-55％）、卵巢癌（18-43％）、子宮內(nèi)膜癌（10-52％）、直腸結腸癌（33-85％）、腎癌（22-36％）、宮頸癌（16-50％）、胃癌（21-64％）、食道癌（10-26％）、前列

5、腺癌（5-46％）、骨肉瘤（40-44％）及成骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移（58％）等，成為一種公認的腫瘤標志物。
　　本研究將信號肽、單鏈抗體、來源于綠膿桿菌的具有膜轉(zhuǎn)位作用的肽段和重組的Caspase-6融合，構建成一種分泌型靶向促凋亡融合蛋白Immunocasp-6（e23sFv-PEⅡ(253-364)-Caspase-6），使其能特異性識別、內(nèi)化并轉(zhuǎn)位進入細胞中，誘導HER2陽性的腫瘤細胞凋亡。
　　首先我們將immunocasp

6、-6融合蛋白亞克隆入真核表達載體pCMV中，構建成一種pCMV-e23sFv-PEⅡ(253-364)-Caspase-6載體(下文簡稱pCMV-6)，采用陽離子脂質(zhì)體法將pCMV-6轉(zhuǎn)染入骨肉瘤SOSP-9607細胞系中，通過間接免疫熒光法、流式細胞術及透射電鏡檢測等方法，對immunocasp-6的促凋亡活性進行了檢測。實驗結果表明該融合蛋白在骨肉瘤SOSP-9607細胞中能夠表達；轉(zhuǎn)染pCMV-6的實驗組細胞變得稀少，體積縮小且核

7、固縮，進一步透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞膜出泡，細胞核濃縮，染色質(zhì)聚集等典型凋亡特征，而轉(zhuǎn)染pCMV-e23sFv-PEⅡ(253-364)（下文簡稱pCMV）的對照組腫瘤細胞形態(tài)正常，細胞結構完整；MTT法檢測到實驗組腫瘤細胞生長明顯慢于對照組腫瘤細胞,流式細胞術進一步檢測發(fā)現(xiàn)實驗組細胞的凋亡率為31.4％,而對照組為6％。
　　接著我們在活體上驗證了immunocasp-6對骨肉瘤的抑瘤效果。將荷瘤裸鼠完全隨機分組，陽離子脂質(zhì)體包裹法

8、將pCMV-6和pCMV分別肌肉注射入裸鼠身上，觀察到實驗組瘤體生長明顯慢于對照組；HE染色、TUNEL染色檢測證明實驗組腫瘤細胞呈現(xiàn)出典型的凋亡特征，而對照組腫瘤細胞結構正常；以抗Caspase-6的抗體進行免疫組織化學染色，結果顯示腫瘤組織為Caspase-6陽性，而其他組織中如肌肉等染色呈Caspase-6陰性。
　　體外、體內(nèi)實驗結果表明：immunocasp-6能特異性識別、結合骨肉瘤SOSP-9607細胞表面的HER2

9、抗原，被內(nèi)吞入細胞后，對細胞底物進行識別、切割，執(zhí)行促凋亡的功能，而對于HER2陰性的其他組織無殺傷及損傷作用。因此，我們構建的immunocasp-6融合蛋白中e23sFv部分仍然保持了其對HER2陽性腫瘤細胞的靶向性識別和結合能力，同樣與抗體融合后的重組型Caspase-6的殺傷活性也不受到影響。
　　綜上所述，immunocasp-6可以靶向性識別、結合并殺傷HER2陽性的骨肉瘤細胞，為骨肉瘤的基因治療提供了一定的實驗基礎。