瘦素經(jīng)JAK2-STAT3信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用.pdf

1、創(chuàng)面愈合是外科學(xué)的重要組成部分，各種創(chuàng)傷、燒傷、放射傷及糖尿病等患者創(chuàng)面長(zhǎng)期不愈更是臨床常見的棘手問(wèn)題。燒傷、創(chuàng)傷后創(chuàng)面的愈合過(guò)程包括出血、炎癥反應(yīng)、再上皮化等過(guò)程，修復(fù)時(shí)間長(zhǎng)；其中上皮化是創(chuàng)面愈合最重要的過(guò)程。創(chuàng)面治療的主要目的就是盡早使創(chuàng)面完成上皮化，從而可減少暴露造成創(chuàng)面感染和肉芽組織過(guò)度增生，進(jìn)而愈合后癱痕組織增生。創(chuàng)面愈合進(jìn)程失控對(duì)患者功能和外觀的恢復(fù)不利。 表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、遷移最終再上皮化是一個(gè)非常復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)

2、有序的生理過(guò)程，這個(gè)過(guò)程由創(chuàng)面環(huán)境釋放的大量細(xì)胞因子所調(diào)控。瘦素是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)16kDa的細(xì)胞因子，最初發(fā)現(xiàn)在脂肪細(xì)胞表達(dá)，由ob基因編碼，在肥胖發(fā)生、體脂信號(hào)傳導(dǎo)中有重要作用。近年來(lái)瘦素被認(rèn)為在創(chuàng)面愈合過(guò)程中可能有重要的促進(jìn)、調(diào)控作用，并且瘦素與促進(jìn)創(chuàng)面愈合的諸多細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)極其相似，為其參與創(chuàng)面愈合提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。瘦素不僅在脂肪組織中合成、分泌到創(chuàng)傷組織，而且皮膚組織受損后傷口組織細(xì)胞也以自分泌或旁分泌的方式合成瘦素，使傷口組織中

3、保持較高的瘦素濃度，這樣有利于創(chuàng)面愈合有關(guān)的生理作用，包括促進(jìn)新生血管生成、調(diào)節(jié)炎癥及免疫功能等。研究表明在傷口組織中的免疫細(xì)胞及修復(fù)細(xì)胞上都有瘦素受體的表達(dá)，而瘦素受體表達(dá)缺失或瘦素一受體信號(hào)傳導(dǎo)障礙均導(dǎo)致明顯的創(chuàng)面愈合延遲，同時(shí)瘦素一受體信號(hào)傳導(dǎo)的激活則可能改善創(chuàng)面愈合。有研究證實(shí)瘦素腹腔內(nèi)注射或局部外用顯著促進(jìn)皮膚切割傷小鼠模型的創(chuàng)面愈合。 可見，瘦素應(yīng)用將可能成為促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、加速創(chuàng)面愈合的新策略。瘦素的作用主要

4、由JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)，明確該信號(hào)傳導(dǎo)途徑在創(chuàng)面愈合信號(hào)傳導(dǎo)中作用，有望促進(jìn)創(chuàng)面愈合的臨床防治。為探討瘦素在表皮缺失創(chuàng)面愈合中的作用及經(jīng)由的跨膜信號(hào)傳導(dǎo)途徑，本研究構(gòu)建了瘦素原核表達(dá)載體并在大腸桿菌高效表達(dá)；觀察了瘦素對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響及JAK2/STAT3信號(hào)通路的作用；建立了Wister大鼠的深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面模型，在體局部外用瘦素后，觀察大鼠背部表皮缺失創(chuàng)面愈合、再上皮化情況。旨在進(jìn)一步深化創(chuàng)面愈合機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為其臨

5、床防治提供新思路和治療靶標(biāo)。 第一部分、基因工程高效重組瘦素。 目的：探索一種操作簡(jiǎn)單、高效表達(dá)重組國(guó)人瘦素的基因工程技術(shù)，為探討瘦素信號(hào)系統(tǒng)在各類重要疾病防治中的作用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。 方法：依據(jù)瘦素序列，設(shè)計(jì)針對(duì)瘦素基因的特異性引物。自重瞼手術(shù)時(shí)所取眶隔脂肪，經(jīng)RNA提取、RT-PCR制備瘦素目的基因，瓊脂糖凝膠電泳后回收、純化擴(kuò)增產(chǎn)物。連接至pMD18T載體，得到pMD18T-leptin質(zhì)粒，送上海生工雙向測(cè)

6、序并雙酶切鑒定；連接至原核表達(dá)載體pET32a，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)后SDS-PAGE電泳，表達(dá)產(chǎn)物變性、復(fù)性后ELISA檢測(cè)抗原反應(yīng)原性。 結(jié)果：提取得到了人脂肪組織總RNA，并保持了良好的完整性。RT-PCR得到500bp左右目的條帶，成功連接到pMD18T、pET32a構(gòu)建pMD18T-leptin、pET32a-leptin，并經(jīng)雙酶切、測(cè)序鑒定。誘導(dǎo)培養(yǎng)6h獲得極高效表達(dá)，目的蛋白占總蛋白50%以上，復(fù)性后重組

7、蛋白的抗原反應(yīng)原性得到了明顯提高。 結(jié)論：自重瞼術(shù)所取眶隔脂肪能成功制備瘦素目的基因，并成功構(gòu)建pET32a-leptin原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)培養(yǎng)6h獲得極高效表達(dá)，變性、復(fù)性后抗原反應(yīng)原性更高，為瘦素生物學(xué)功能的進(jìn)一步研究提供了充足的物質(zhì)保障。 第二部分、瘦素經(jīng)JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的作用。 目的：闡明瘦素對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的作用，及JAK2/STAT3在介導(dǎo)瘦素信號(hào)跨膜傳導(dǎo)中的作用；探討

8、瘦素在創(chuàng)面愈合中的可能作用及機(jī)制，為創(chuàng)面愈合臨床防治提供新策略及靶標(biāo)。 方法：人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞原代培養(yǎng)并鑒定。觀察瘦素對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的時(shí)間梯度作用，將細(xì)胞隨機(jī)分為六組：瘦素作用24h（L-24h）組、瘦素作用48h（L-48h）組、瘦素作用72h（L-72h）組及三個(gè)時(shí)間相匹配的對(duì)照組，即24h對(duì)照（C-24h）組、48h對(duì)照（C-48h）組、72h對(duì)照（C-72h）組，瘦素作用組為含100ng/ml瘦素的D-KSFM，對(duì)照組

9、為不含瘦素的D-KSFM，于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞行MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖；觀察瘦素對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的濃度梯度作用，將細(xì)胞隨機(jī)分為六組：空白對(duì)照組、50ng/ml組、100ng/ml組、200ng/ml組、400ng/ml組、800ng/ml組；分別加入含瘦素0、50、100、200、400、800ng/ml的D-KSFM；培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞行MTT、透射電鏡檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡；觀察JAK抑制劑AG490對(duì)瘦素促增殖作用的影響，將細(xì)胞隨機(jī)分為四

10、組：空白對(duì)照組、瘦素組、AG490組、AG490+瘦素組。分別加入D-KSFM、含100ng/ml瘦素的D-KSFM、含25umol/lAG490的D-KSFM、含25umol/l AG490及100ng/ml瘦素的D-KSFM；培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞行MTT檢測(cè)、流式細(xì)胞檢測(cè)、CK17免疫細(xì)胞化學(xué)染色、磷酸化STAT3蛋白Western blot檢測(cè)。 結(jié)果：作用24h、48h、72h后，瘦素作用組均較對(duì)照組有明顯的細(xì)胞增殖，差

11、異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為p<0．05）。在0-400ng/ml濃度范圍，瘦素干預(yù)組細(xì)胞均較對(duì)照組MTT檢測(cè)OD值升高，有明顯的細(xì)胞增殖，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0．05）；在800ng/ml濃度，瘦素作用組較對(duì)照組細(xì)胞數(shù)更少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0．05）；細(xì)胞凋亡增加。流式細(xì)胞檢測(cè)顯示，瘦素組較對(duì)照組G0/G1靜止期細(xì)胞比例更低（3．98% vs8．11%）； AG490+瘦素組與瘦素組比較，靜止期細(xì)胞比例增加（4．32% vs3．9

12、8%）。CK17免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘦素組較對(duì)照組著色更深、著色細(xì)胞數(shù)更多；而AG490+瘦素組較瘦素組著色更淺、著色細(xì)胞數(shù)更少。Western blot顯示，瘦素組較對(duì)照組磷酸化STAT3蛋白表達(dá)增加，AG490+瘦素組較瘦素組表達(dá)減少。 結(jié)論：100ng/ml瘦素對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞有時(shí)間依賴性促增殖作用。0-400ng/ml濃度范圍內(nèi)，瘦素對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞有濃度依賴性促增殖作用，但800ng/ml反而抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、增加

13、細(xì)胞凋亡。AG490能有效抑制瘦素對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的促增殖作用，并減少磷酸化STAT3的表達(dá)，提示JAK2/STAT3信號(hào)途徑參與瘦素的跨膜信號(hào)傳導(dǎo)，阻斷該信號(hào)傳導(dǎo)途徑能減少角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。 第三部分、局部應(yīng)用瘦素對(duì)大鼠燙傷創(chuàng)面愈合的實(shí)驗(yàn)研究。 目的：建立Wister大鼠的深Ⅱ℃燙傷創(chuàng)面模型，外用瘦素來(lái)觀察和研究瘦素在Waster大鼠燙傷創(chuàng)面愈合中的作用和意義，探討瘦素在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中的作用及其機(jī)制。 方法：選

14、用清潔級(jí)Wistar大鼠18只，雌雄不拘，體重220-250g。全身麻醉下用“控時(shí)控溫控蒸汽壓燙傷儀”在溫度為108℃，壓力為0．03MPa，時(shí)間為4 sec時(shí)，在大鼠背部?jī)蓚?cè)平行燙四個(gè)相同大小和深度的燙傷創(chuàng)面（燙傷后做皮膚病理切片證實(shí)為深Ⅱ℃），每個(gè)創(chuàng)面面積為1．8cm×2．5cm大小。將所有創(chuàng)面分為兩組，創(chuàng)面涂400ng/ml的瘦素溶液（用PBS釋?。?，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組；每只燙傷大鼠靠近尾部的兩個(gè)并排創(chuàng)面，外涂PBS，設(shè)為對(duì)照組。每天9：

15、00和18：00各涂一次，實(shí)驗(yàn)為三周。記錄創(chuàng)面完全重上皮化所需要的時(shí)間為創(chuàng)面愈合時(shí)間；在燙傷后第3，7，11，15，19d 5個(gè)時(shí)相點(diǎn)測(cè)量創(chuàng)面的上皮化率；于傷后第7、14天和21天用手術(shù)刀切取各組的傷口及周邊皮膚，做HE及免疫組化染色（PCNA），以觀察創(chuàng)面的愈合時(shí)間和組織形態(tài)以及角質(zhì)形成細(xì)胞在燙傷創(chuàng)面愈合過(guò)程增殖和遷移情況。 結(jié)果：創(chuàng)面愈合過(guò)程中，對(duì)照組肉芽顆粒較粗大，創(chuàng)面出現(xiàn)皮島較晚，創(chuàng)緣上皮爬行慢；而實(shí)驗(yàn)組肉芽略顯細(xì)小，創(chuàng)

16、面出現(xiàn)皮島較早，創(chuàng)緣上皮爬行快。實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面愈合時(shí)間快于對(duì)照組2-3天左右。平均愈合天數(shù)：對(duì)照組為21．3±2．05d，實(shí)驗(yàn)組為18．47±1．52d，實(shí)驗(yàn)組愈合天數(shù)與對(duì)照組相比，差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0．00）。在燙傷后第19d，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面愈合率為97．48±1．63，對(duì)照組創(chuàng)面愈合率為84．84±2．50，在7、11、15天和19天四個(gè)時(shí)相點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組愈合率與對(duì)照組比較差異均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0．00）。在傷后7、14天和

17、21天創(chuàng)緣組織HE染色可見：實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)周表皮反應(yīng)性增生快，表皮層明顯厚于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面上皮化過(guò)程短于對(duì)照組。PCNA免疫組化染色結(jié)果顯示陽(yáng)性細(xì)胞主要集中于近創(chuàng)緣組織、創(chuàng)面基底部、以及殘留的皮脂腺等皮膚附屬器和新生的肉芽組織和表皮細(xì)胞中，且首先主要表達(dá)在近創(chuàng)緣組織和皮膚基底層中。實(shí)驗(yàn)組在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)PCNA的染色深度比對(duì)照組更深、著色細(xì)胞數(shù)量明顯比對(duì)照組要多，實(shí)驗(yàn)組燙傷后7d、14d和21d皮膚基底細(xì)胞和上皮細(xì)胞PCNA表達(dá)積分為比較：實(shí)