高血壓易感基因CYP4F2轉(zhuǎn)基因小鼠模型的鑒定及CYP4F2-20-HETE途徑的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 細(xì)胞色素P4504F2(cytochrome P4504F2,CYP4F2)通過ω-羥化作用將花生四烯酸(arachidonic acid,AA)代謝為20-羥基二十碳四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid,20-HETE),是人類腎臟產(chǎn)生20-HETE最主要的酶。20-HETE通過調(diào)節(jié)血管和腎小管的活性而影響動脈血壓:一方面,20-HETE收縮外周血管,并增強(qiáng)其它血管活性物質(zhì)的縮血

2、管效應(yīng)而起促高血壓作用；另一方面,20-HETE抑制腎臟近端小管和髓袢升支粗段對鈉離子的重吸收而起抗高血壓作用。本課題組前期對遼寧省西部高血壓病高發(fā)區(qū)人群的關(guān)聯(lián)研究表明,CYP4F2基因調(diào)控區(qū)功能性多態(tài)上調(diào)了該基因轉(zhuǎn)錄活性,增強(qiáng)了代謝產(chǎn)物20-HETE的生成,與高血壓發(fā)病呈正相關(guān)。我們的結(jié)論與Ward等對白種人群報(bào)道的CYP4F2V433M多態(tài)與20-HETE生成增多及血壓升高呈正相關(guān)結(jié)論一致。然而,Gainer等則認(rèn)為20-HETE的

3、另一合酶CYP4A11 F434S多態(tài)性降低了轉(zhuǎn)錄活性,與高血壓呈負(fù)相關(guān)。因此,建立高血壓易感基因CYP4F2的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,將是從整體水平分析20-HETE對血壓的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制的重要手段。
　　 腎臟雄激素調(diào)節(jié)蛋白(kidney androgen-regulated protein,KAP)是小鼠腎臟近端小管表達(dá)的高豐度蛋白,與人CYP4F2在腎臟的表達(dá)部位基本一致。KAP啟動子活性受雄激素、雌激素等多種激素的調(diào)節(jié),其中以

4、對雄激素的反應(yīng)性最為明顯。已有學(xué)者建立KAP-hAGT、KAP-LUC等轉(zhuǎn)基因小鼠模型,并成功地實(shí)現(xiàn)了雄激素對轉(zhuǎn)基因在小鼠腎臟的誘導(dǎo)表達(dá)。因此,選擇KAP啟動子構(gòu)建CYP4F2轉(zhuǎn)基因小鼠模型,旨在強(qiáng)調(diào)CYP4F2在小鼠腎臟的優(yōu)勢表達(dá),兼顧20-HETE的雙重血壓調(diào)節(jié)作用,并為實(shí)現(xiàn)CYP4F2的雄激素誘導(dǎo)表達(dá)提供可行性。
　　 本研究通過建立CYP4F2轉(zhuǎn)基因小鼠模型,從整體水平鑒定CYP4F2/20-HETE代謝通路對血壓的調(diào)節(jié)

5、作用,并進(jìn)一步以該模型作為研究平臺,借助雄激素誘導(dǎo)CYP4F2的表達(dá)及效應(yīng),為闡明CYP4F2/20-HETE對高血壓的具體調(diào)節(jié)機(jī)制提供有力的條件。
　　 材料與方法
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料:
　　 1、FVB/N小鼠
　　 2、人HEK293、HUVEC細(xì)胞系
　　 3、基因克隆及螢光素酶報(bào)告基因檢測相關(guān)試劑
　　 4、Southern blot、Western blot及免疫組化相關(guān)試劑<

6、br>　　 5、20-HET EELISA檢測、醛固酮放免檢測相關(guān)試劑
　　 6、Real-time PCR相關(guān)試劑
　　 7、ROS特異性熒光染料DHE及NO特異性熒光染料DAF-2 DA
　　 8、MDA及SOD檢測相關(guān)試劑
　　 9、氧化應(yīng)激基因mRNA芯片
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、構(gòu)建pKAP-LUC、pKAP-CYP4F2/his載體,轉(zhuǎn)染人腎臟細(xì)胞系HEK293,雙螢

7、光素酶檢測系統(tǒng)檢測LUC活性,以CYP4F2抗體和his標(biāo)簽抗體Western blot檢測CYP4F2的表達(dá),細(xì)胞水平判斷KAP啟動子活性。
　　 2、將pKAP-CYP4F2/his載體雙酶切線性化,膠回收純化轉(zhuǎn)基因片段,顯微注射至FVB/N小鼠受精卵,產(chǎn)生CYP4F2轉(zhuǎn)基因Founder小鼠。提取鼠尾DNA,以CYP4F2特異性探針及引物,經(jīng)Southern blot及PCR雙重鑒定陽性小鼠,建立轉(zhuǎn)基因系。
　　

8、3、提取小鼠腎臟等十余種組織的總蛋白并定量,his標(biāo)簽抗體Western blot檢測CYP4F2的表達(dá)譜。以4％多聚甲醛固定腎臟等組織塊,石蠟切片,免疫組化鑒定CYP4F2的表達(dá)定位。提取腎臟微粒體蛋白,his標(biāo)簽抗體Western blot檢測CYP4F2在微粒體酶中的表達(dá)。
　　 4、將腎臟微粒體蛋白與AA底物、NADPH輔酶等成分孵育,建立體外的AA羥化反應(yīng)體系,ELISA試劑盒檢測20-HETE生成量。收集小鼠尿液,E

9、LISA試劑盒檢測尿20-HETE的水平。
　　 5、無創(chuàng)鼠尾血壓儀測量轉(zhuǎn)基因小鼠收縮壓(SBP),并抽樣以有創(chuàng)的頸動脈插管法評估前種方法的有效性。動態(tài)監(jiān)測8-40周齡小鼠的血壓變化情況。小鼠眶后靜脈叢采血并分離血漿及血清,放射免疫法測量血漿醛固酮水平,干片法測量血清肌酐(CRE)、尿素氮(BUN),判斷腎功能。
　　 6、對雌性轉(zhuǎn)基因小鼠連續(xù)兩周腹腔注射雄激素誘導(dǎo)劑5α-雙氫睪酮(dihydrotestosterone

10、,DHT),his標(biāo)簽抗體Western blot檢測誘導(dǎo)后腎臟CYP4F2的表達(dá)情況。ELISA試劑盒檢測誘導(dǎo)后微粒體對AA羥化孵育反應(yīng)的20-HETE產(chǎn)量,并測量小鼠尿20-HETE的排泌水平。鼠尾動脈血壓儀測量誘導(dǎo)后小鼠血壓的變化。
　　 7、對雄性轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)施去勢術(shù)清除內(nèi)源的雄激素分泌,再給與外源DHT誘導(dǎo)劑,分別檢測腎臟CYP4F2的表達(dá)、代謝產(chǎn)物20-HETE及小鼠血壓,并與誘導(dǎo)前加以比較。
　　 8、對小

11、鼠實(shí)施DHT及20-HETE特異性抑制劑HET0016共給藥,檢測尿20-HETE及動脈血壓,進(jìn)一步確認(rèn)20-HETE在DHT誘導(dǎo)的高血壓中的作用。
　　 9、提取DHT誘導(dǎo)小鼠腎臟總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,Real-time PCR檢測DHT對小鼠內(nèi)源性20-HETE合酶cyp4a12、cyp4a14、cyp4a10的表達(dá)調(diào)控。
　　 10、以DHT分別刺激人HEK293細(xì)胞0.5小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí),CYP4F

12、2抗體Western blot檢測雄激素對人CYP4F2的誘導(dǎo)表達(dá)作用。
　　 11、檢測轉(zhuǎn)基因小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo):DHE染色法檢測胸主動脈、腎臟冰凍切片活性氧自由基(ROS)、試劑盒檢測血漿及腎組織勻漿液脂質(zhì)過氧化標(biāo)記物丙二醛(MDA)、試劑盒檢測血漿及腎組織勻漿液總體超氧化物歧化酶(SOD)活力。
　　 12、以SOD類似物Tempol添加到飲水中抑制氧化應(yīng)激,檢測轉(zhuǎn)基因小鼠SBP的變化,確立氧化應(yīng)激對轉(zhuǎn)基因小鼠高

13、血壓發(fā)生的重要作用。
　　 13、提取腎臟總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過Real-time PCR儀進(jìn)行氧化應(yīng)激相關(guān)基因的mRNA芯片檢測,篩查轉(zhuǎn)基因與野生型小鼠之間差異表達(dá)的氧化應(yīng)激基因。
　　 14、以芯片篩查的差異表達(dá)基因Nos2作為靶基因,對整個(gè)NOS家族的每個(gè)成員(iNOS、nNOS、eNOS),進(jìn)行Western blot驗(yàn)證小鼠腎臟蛋白質(zhì)水平的表達(dá)差異。
　　 15、體外培養(yǎng)人HUVEC、HEK2

14、93細(xì)胞系并施加20-HETE刺激,DHE熒光染料檢測ROS水平,分析20-HETE對細(xì)胞氧化應(yīng)激的誘發(fā)作用。DAF-FM熒光染料檢測NO水平,分析20-HETE對細(xì)胞整體NO水平的影響。
　　 結(jié)論
　　 1、成功地建立了高血壓易感基因CYP4F2的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,CYP4F2/20-HETE代謝通路功能性獲得,引起轉(zhuǎn)基因小鼠呈現(xiàn)慢性高血壓表型。因此,從整體水平證明CYP4F2/20-HETE起促高血壓作用。
　

15、　 2、雄激素明顯誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟CYP4F2的表達(dá),放大了CYP4F2/20-HETE通路的效應(yīng),并引起雄激素依賴性高血壓。雄激素對人腎臟細(xì)胞CYP4F2的誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)一步提示CYP4F2/20-HETE通路可能是人類高血壓性別差異的機(jī)制之一。
　　 3、轉(zhuǎn)基因小鼠氧化應(yīng)激水平明顯升高,抑制氧化應(yīng)激明顯改善了高血壓表型,氧化應(yīng)激相關(guān)基因存在較廣泛的表達(dá)差異,提示氧化應(yīng)激是CYP4F2轉(zhuǎn)基因小鼠高血壓發(fā)生的關(guān)鍵,參與了CYP