CYP3A4-1G對(duì)HepG2細(xì)胞CYP3A4基因表達(dá)的調(diào)控作用及機(jī)制.pdf

1、背景與目的：
　　大多數(shù)藥物經(jīng) CYP450酶代謝。CYP酶基因的變異可導(dǎo)致藥物不良反應(yīng)，這成為影響藥物安全及患者依從性的主要原因之一。CYP3A4是CYP3A亞家族中最主要的成員之一，占P450酶系總量的30％～40％，主要分布在肝臟和腸道。CYP3A4*1G（G>A，rs2242480）是CYP3A4內(nèi)含子10中的一個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP），其等位基因頻率在不同民族人群中存在明顯差異。這個(gè)等位基因在高加索人群中少見，但在亞洲

2、人群基因頻率超過(guò)20%。體內(nèi)研究表明CYP3A4*1G基因多態(tài)性與他克莫司、阿托伐他汀、芬太尼等藥物的劑量、療效及藥動(dòng)學(xué)改變有關(guān)。本課題組前期用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)在 HepG2細(xì)胞中，CYP3A4內(nèi)含子10具有受CYP3A4*1G等位基因調(diào)控的增強(qiáng)子與啟動(dòng)子活性，并發(fā)現(xiàn) CYP3A4*1G位點(diǎn)附近存在抑制性作用元件。但 CYP3A4*1G及其調(diào)控的CYP3A4內(nèi)含子10與CYP3A4基因表達(dá)之間的關(guān)系尚不清楚。本研究的目的是探究

3、CYP3A4內(nèi)含子10及CYP3A4*1G對(duì)HepG2細(xì)胞CYP3A4表達(dá)的影響?；虮磉_(dá)可由轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物調(diào)控。具有啟動(dòng)子和增強(qiáng)子活性的CYP3A4內(nèi)含子10與某些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控CYP3A4基因的表達(dá)。因此本研究的另一目的是探討與 CYP3A4*1G及其側(cè)翼序列相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，為從內(nèi)含子 SNP調(diào)控基因表達(dá)角度解釋CYP3A4酶活性的個(gè)體差異提供分子機(jī)制，進(jìn)而為臨床個(gè)體化用藥和與用藥相關(guān)的法醫(yī)學(xué)鑒定提供理論基礎(chǔ)。
　　

4、方法：
　　構(gòu)建一系列真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，qPCR檢測(cè)CYP3A4 mRNA水平，分別對(duì)其進(jìn)行啟動(dòng)子功能分析（陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照Ⅰ組、野生啟動(dòng)子組、突變啟動(dòng)子組），上游增強(qiáng)子功能分析（陽(yáng)性對(duì)照Ⅰ組、野生增強(qiáng)子組、突變?cè)鰪?qiáng)子組、反向野生增強(qiáng)子組、反向突變?cè)鰪?qiáng)子組），下游增強(qiáng)子功能分析（陽(yáng)性對(duì)照Ⅱ組、下游野生增強(qiáng)子組、下游突變?cè)鰪?qiáng)子組、下游反向野生增強(qiáng)子組、下游反向突變?cè)鰪?qiáng)子組）。應(yīng)用SPSS21.0對(duì)

5、數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較CYP3A4 mRNA表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　提取 HepG2細(xì)胞核蛋白，加入生物素標(biāo)記 CYP3A4*1G野生型及突變型探針，鏈霉親和素pull-down，聚丙烯酰胺凝膠電泳后硝酸銀染色，HPLC-MS/MS質(zhì)譜分析CYP3A4*1G結(jié)合的蛋白。
　　結(jié)果：
　　(1) CYP3A4內(nèi)含子10啟動(dòng)子功能分析結(jié)果：陽(yáng)性對(duì)照Ⅰ組、野生啟動(dòng)子組、突變啟動(dòng)子

6、組均能夠有效地啟動(dòng)CYP3A4基因表達(dá)。野生啟動(dòng)子組與陽(yáng)性對(duì)照Ⅰ組 CYP3A4 mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異（P>0.05），突變啟動(dòng)子組 CYP3A4 mRNA表達(dá)水平顯著低于陽(yáng)性對(duì)照Ⅰ組（P<0.05）和野生啟動(dòng)子組（P<0.01）；
　　(2) CYP3A4內(nèi)含子10上游增強(qiáng)子功能分析結(jié)果：無(wú)論CYP3A4*1G野生型還是突變型，反向組CYP3A4 mRNA表達(dá)水平均高于正向組（P<0.01）；而CYP3A4內(nèi)含子10無(wú)論

7、是正向還是反向，CYP3A4*1G野生型組CYP3A4 mRNA表達(dá)水平均高于突變型組（P<0.01）；此外，突變?cè)鰪?qiáng)子組CYP3A4 mRNA表達(dá)水平低于陽(yáng)性對(duì)照Ⅰ組，不但沒(méi)有增強(qiáng)CYP3A4啟動(dòng)子的功能反而有所減弱。
　　(3) CYP3A4內(nèi)含子10下游增強(qiáng)子功能分析結(jié)果：CYP3A4內(nèi)含子10無(wú)論正向、反向、野生、突變均增強(qiáng)了 CYP3A4啟動(dòng)子的活性，但該增強(qiáng)作用弱且不受CYP3A4*1G調(diào)控，盡管正向的增強(qiáng)水平高于反向

8、，但對(duì)方向的依賴性并不十分顯著。
　　(4) CYP3A4*1G及其側(cè)翼序列結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子分析結(jié)果：聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染結(jié)果顯示突變型標(biāo)記探針組結(jié)合蛋白條帶數(shù)明顯多于野生型標(biāo)記探針組，且顏色深淺有區(qū)別；分別加對(duì)應(yīng)的冷探針后，兩者的特異性蛋白條帶明顯減少，且條帶的顏色深淺差別更明顯；鏈霉親和素 pull-down蛋白溶液 HPLC-MS/MS結(jié)果顯示突變型標(biāo)記探針結(jié)合蛋白數(shù)目（738個(gè)）多于野生型標(biāo)記探針結(jié)合蛋白數(shù)目（697個(gè)）。<