基于rasH2轉(zhuǎn)基因小鼠模型的F3SM短期致癌試驗(yàn)研究.pdf

1、目的:建立rasH2轉(zhuǎn)基因小鼠短期致癌模型，并利用該模型對(duì)新型PPARβ/δ激動(dòng)劑F3SM進(jìn)行致癌性評(píng)價(jià);同時(shí)進(jìn)行伴隨毒代動(dòng)力學(xué)觀察，了解試驗(yàn)期間藥物在動(dòng)物體內(nèi)的代謝情況，幫助完整解釋藥物毒性的發(fā)生。
　　方法:1.C57BL/6（后文中簡(jiǎn)稱C57）小鼠重復(fù)給藥4周毒性試驗(yàn):以4個(gè)劑量(0，40，120，360 mg/kg)的F3SM對(duì)C57小鼠進(jìn)行28天連續(xù)灌胃給藥，每日觀察不同劑量組小鼠毒性反應(yīng)及死亡情況，給藥結(jié)束后剖殺一批動(dòng)

2、物，測(cè)量臟器系數(shù)，測(cè)定血液生化、血液學(xué)指標(biāo)，并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，以確定此條件下藥物對(duì)小鼠的最大無(wú)損害效應(yīng)水平(NOAEL)和最大耐受劑量(MTD);剩余動(dòng)物進(jìn)行為期2周的恢復(fù)期觀察，了解藥物在給藥期間對(duì)動(dòng)物損傷的可逆性;同時(shí)設(shè)置毒代衛(wèi)星組，于首次、末次給藥監(jiān)測(cè)毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，觀察連續(xù)給藥期間藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝情況。2.rasH2小鼠和C57小鼠毒代動(dòng)力學(xué)對(duì)比試驗(yàn):單次灌胃C57小鼠和rasH2轉(zhuǎn)基因小鼠60 mg/kg的F3SM，在給

3、藥后5min，15min，30min，1h，3h，10h和24h，共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行采血，采血量＞40μL，采血方式為頜下靜脈采血。采用LC-MS/MS方法對(duì)樣品的藥物濃度進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算得出藥時(shí)曲線下面積(AUC0-t)、滯留時(shí)間(MRT0-t)、半衰期(t1/2)、達(dá)峰時(shí)間(Tmax)和達(dá)峰濃度（Cmax）幾項(xiàng)參數(shù)，用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析。初步判斷兩種小鼠對(duì)F3SM代謝的一致性。3.轉(zhuǎn)基因小鼠6個(gè)月致癌試驗(yàn):采用rasH2轉(zhuǎn)基因小鼠模型

4、，設(shè)立空白對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，溶劑對(duì)照組和4個(gè)F3SM劑量組(30，60，120，240mg/kg)，每個(gè)F3SM劑量組各按性別設(shè)有毒代衛(wèi)星組，15只/性別/劑量。除空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，所有其余動(dòng)物每天灌胃給藥1次，每周6天，連續(xù)給藥6個(gè)月;陽(yáng)性對(duì)照藥物選用國(guó)際通用的氨基甲酸乙酯，于給藥期第1，3，5天腹腔注射給藥。給藥期間每日觀察不同劑量組小鼠毒性反應(yīng)及死亡情況，尤其注意觀察腫物的發(fā)生情況，詳細(xì)記錄。給藥結(jié)束后剖殺主試驗(yàn)動(dòng)物，計(jì)算

5、死亡率，測(cè)量臟器系數(shù)，測(cè)定血液生化、血液學(xué)指標(biāo)，并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，統(tǒng)計(jì)各組別各器官腫瘤的發(fā)生率，分析F3SM的潛在致癌毒性。
　　結(jié)果:1.C57BL/6小鼠重復(fù)給藥4周毒性試驗(yàn):臟器系數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示給藥組低、中、高、最高劑量動(dòng)物肝臟臟器系數(shù)均顯著高于正常對(duì)照組(p＜0.01)，并表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系;停藥2周后，各劑量組均得到明顯恢復(fù)，與正常對(duì)照組比較均無(wú)明顯差異。首次給藥后，藥物在動(dòng)物體內(nèi)暴露量與劑量基本成比例，滯留

6、時(shí)間沒(méi)有顯著延長(zhǎng);連續(xù)給藥4周后，三個(gè)劑量組動(dòng)物藥物吸收量降低，暴露量降低，未出現(xiàn)蓄積現(xiàn)象。血液生化指標(biāo)和血液學(xué)指標(biāo)顯示藥物主要使小鼠血清中ALT、ALP、Tchol水平升高，使Glu、TG下降，有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，停藥2周后各指標(biāo)恢復(fù)或有恢復(fù)趨勢(shì)。病理結(jié)果表明，小鼠灌胃F3SM重復(fù)給藥4周后，360、120與40 mg/kg劑量下均可引起肝細(xì)胞明顯肥大，360 mg/kg劑量可致肝細(xì)胞輕度增生。停藥2周后肝細(xì)胞肥大與增生均可完全恢

7、復(fù)。2.rasH2小鼠和C57小鼠毒代動(dòng)力學(xué)對(duì)比試驗(yàn):兩種小鼠單次給予60 mg/kg F3SM后，血藥濃度-時(shí)間(c-t)曲線顯示給藥后的趨勢(shì)基本一致，差異不顯著;對(duì)兩種小鼠單次給藥后的AUC(0-t)、MRT(0-t)、t1/2、Tmax和Cmax幾項(xiàng)參數(shù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，其差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05，t檢驗(yàn))。3.轉(zhuǎn)基因小鼠6個(gè)月致癌試驗(yàn):試驗(yàn)終期，空白對(duì)照組動(dòng)物自發(fā)脾臟腫瘤3例（1例脾血管瘤，2例脾血管肉瘤）;陽(yáng)性對(duì)照組

8、動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)全部死亡，肺腺瘤發(fā)生率達(dá)90％。空白對(duì)照組和陽(yáng)性組動(dòng)物在試驗(yàn)期間存活率、腫瘤發(fā)生類型、部位和概率均與文獻(xiàn)報(bào)道一致。其余各給藥組生存率均大于85％、體重下降范圍基本在10％以內(nèi)。血液生化和血液學(xué)指標(biāo)提示了F3SM對(duì)肝臟的損傷和動(dòng)物應(yīng)激;臟器系數(shù)結(jié)果明確提示肝臟腫大，且劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯。組織病理學(xué)詳細(xì)記錄了所有死亡及剖殺動(dòng)物各個(gè)器官的病變及腫瘤發(fā)生情況，經(jīng)綜合統(tǒng)計(jì)分析腫瘤的發(fā)生情況得出，60，120，240mg/kg劑量下的

9、F3SM均在雄性動(dòng)物中導(dǎo)致了肝腺瘤發(fā)生。連續(xù)給藥26周，30，60和120mg/kg劑量的F3SM在rasH2小鼠體內(nèi)均未見(jiàn)明顯蓄積，240mg/kg劑量連續(xù)13周給藥后暴露量增加，雌性動(dòng)物有蓄積傾向，連續(xù)26周給藥體內(nèi)暴露量降低，未見(jiàn)明顯蓄積。
　　結(jié)論:1.C57BL/6小鼠重復(fù)給藥4周毒性試驗(yàn):本次試驗(yàn)條件下(0，40，120，360mg/kg4個(gè)劑量組，每天給藥1次，每周7次)，最大無(wú)損害效應(yīng)水平(NOAEL):40mg/

10、kg;最大耐受劑量(MTD):120mg/kg。主要可能的毒性靶器官為肝臟、胸腺，呈現(xiàn)一定可恢復(fù)性。2.rasH2小鼠和C57小鼠毒代動(dòng)力學(xué)對(duì)比試驗(yàn):以60mg/kg劑量分別單次灌胃C57小鼠和rasH2轉(zhuǎn)基因小鼠，血藥濃度-時(shí)間(c-t)曲線和代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)顯示本次試驗(yàn)中兩種小鼠對(duì)F3SM的代謝大體無(wú)差異。提示C57小鼠重復(fù)給藥4周試驗(yàn)的結(jié)果能夠?qū)asH2轉(zhuǎn)基因小鼠試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)提供有利的依據(jù)。3.rasH2轉(zhuǎn)基因小鼠模型6個(gè)月致癌

11、試驗(yàn):空白對(duì)照組和陽(yáng)性組動(dòng)物在試驗(yàn)期間存活率、腫瘤發(fā)生類型、部位和概率均與文獻(xiàn)報(bào)道一致，模型建立成功。其余各給藥組生存率、體重變化范圍均在條件允許范圍之內(nèi)，保證了試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)的完整、良好的背景。血液生化和血液學(xué)指標(biāo)提示了F3SM對(duì)肝臟的損傷和動(dòng)物應(yīng)激;臟器系數(shù)結(jié)果明確提示肝臟腫大，且劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯。給藥期間30，60和120mg/kg劑量的F3SM在rasH2小鼠體內(nèi)均未見(jiàn)明顯蓄積。240mg/kg劑量連續(xù)13周給藥后暴露量增加，雌