中國(guó)NSCLC人群EGFR基因突變特點(diǎn)及EGFR-TKI作用機(jī)理研究.pdf

1、肺癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，我國(guó)2000年世界人口調(diào)整肺癌男性發(fā)病率為38.46/10萬(wàn)，死亡率為33.21/10萬(wàn)。女性調(diào)整發(fā)病率為15.70/10萬(wàn)，死亡率為13.45/10萬(wàn)，居各類(lèi)惡性腫瘤死亡率首位。盡管近年來(lái)化療、放療有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但肺癌總的長(zhǎng)期生存率并未得到明顯提高。當(dāng)肺癌被確診時(shí)，65％屬于晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，早期患者手術(shù)后需要接受輔助化療，術(shù)后幾年內(nèi)很多患者也會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，因此幾乎所有的

2、非小細(xì)胞肺癌患者均需要進(jìn)行輔助化療或者姑息化療?；熓悄壳翱梢钥刂七h(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要治療方法，但其緩解率低，臨床試驗(yàn)顯示第三代化療藥物作為一線化療的有效率約為30～40％，二線化療的有效率僅有10％，且?guī)缀跛谢颊咦罱K將出現(xiàn)新的轉(zhuǎn)移病灶，因此發(fā)展新的治療方法成為研究的熱點(diǎn)。 近年來(lái)，隨著對(duì)于腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究不斷深入，人們對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入，針對(duì)腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路特異性分子靶點(diǎn)抗腫瘤治療

3、新方法，具有針對(duì)腫瘤治療特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，效果顯著，是腫瘤治療中甚具前景的方法。在非小細(xì)胞肺癌中EGFR的研究最為深入。 臨床上EGFR-TKI通過(guò)與ATP競(jìng)爭(zhēng)EGFR胞內(nèi)區(qū)激酶催化位點(diǎn)，阻斷EGFR激酶活性。吉非替尼(Gefitinib，IressaTM)是一種特異性的EGFR酪氨酸激酶抑制劑，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地抑制ATP與受體胞內(nèi)區(qū)結(jié)合，從而抑制酪氨酸激酶活化，阻斷EGFR的傳導(dǎo)通路，達(dá)到抗腫瘤治療的目的。 臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示

4、吉非替尼的療效在不同的人群中差異較大，日本患者和歐洲患者中有效率分別為27.5％和10.4％。2004年，研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)EGFR基因18、19、21外顯子突變的NSCLC患者對(duì)吉非替尼的療效較好，而這種突變多見(jiàn)于東亞人種、女性、非吸煙者、腺癌的患者。但在臨床中卻顯示部分EGFR基因野生型的患者同樣對(duì)吉非替尼治療療效較好，也有研究結(jié)果提示除了EGFR突變，EGFR-TKI治療的療效還與EGFR基因的拷貝數(shù)有關(guān)。因此影響吉非替尼療效及預(yù)后的原

5、因尚不明確。 本研究通過(guò)檢測(cè)對(duì)中國(guó)NSCLC患者EGFR基因突變的情況，試圖闡明突變與臨床之間的關(guān)系，探討EGFR基因突變對(duì)。EGFR-TKI治療療效和預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值；通過(guò)原代培養(yǎng)的方法建立EGFR基因野生型EGFR高拷貝數(shù)的肺癌細(xì)胞系并對(duì)其進(jìn)行鑒定；通過(guò)觀察吉非替尼對(duì)該肺癌細(xì)胞系EGFR下游信號(hào)通路分子表達(dá)的影響，探討EGFR-TKI藥物對(duì)EGFR基因野生型EGFR高拷貝數(shù)的肺癌細(xì)胞系生長(zhǎng)及下游信號(hào)傳導(dǎo)的影響。 第1章

6、 NSCLC患者EGFR基因突變的檢測(cè)與臨床意義 材料與方法 1、病例選擇： 研究包括從2002年至2005年期間在廣東省人民醫(yī)院接受手術(shù)的144例非小細(xì)胞肺癌患者，所有患者均簽署了知情同意書(shū)，手術(shù)切除的腫瘤組織立刻置于液氮中，然后保存于-80℃。其中27例患者在疾病出現(xiàn)進(jìn)展，二線化療失敗后接受了吉非替尼250mg口服／天治療，直至疾病再次進(jìn)展或出現(xiàn)不可耐受的毒副作用，患者在治療后4周接受胸片或CT檢查評(píng)價(jià)

7、療效，以后每3個(gè)月復(fù)查一次，療效評(píng)價(jià)按照RECIST標(biāo)準(zhǔn)。組織病理學(xué)分型按照WHO標(biāo)準(zhǔn)。 2、基因組DNA的提取： 采用Trizol一步法提取腫瘤組織的的RNA和DNA。 3、PCR擴(kuò)增EGFR基因與測(cè)序： 采用巢式PCR擴(kuò)增EGFR基因18、19、21外顯子，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物后回收純化PCR產(chǎn)物，BigDye標(biāo)記測(cè)序序列后上機(jī)測(cè)序。 4、統(tǒng)計(jì)方法： 以P＜0.05作為有顯

8、著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。不同組間突變率的差異采用x2檢驗(yàn)或者Fisher精確概率檢驗(yàn)。多因素分析采用logistic回歸模型進(jìn)行檢驗(yàn)。疾病進(jìn)展時(shí)間比較采用Kaplan-Meier檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS軟件進(jìn)行。 結(jié)果 在27例接受吉非替尼治療的患者(20例腺癌、3例肺泡細(xì)胞癌、2例鱗癌、2例大細(xì)胞癌)中，總的有效率(CR+PR)為48.1％(13/27)；男性和女性分別為43.8％(7.16)和54.5％(6/11)，p

9、=0.436；非吸煙者和吸煙者分別為60％(9/15)和33.3％(4/12)，p=0.090；腺癌和非腺癌分別為56.5％(12/23)和O％(0/4)，p=0.057，EGFR野生型和突變型患者疾病控制率分別為36.4％(4/11)和56.3％(9/16)，p=0.267。男性和女性的中位TTP沒(méi)有顯著差異(16個(gè)月VS.13個(gè)月，p=0.411)，不同吸煙狀況的患者中位TTP沒(méi)有顯著差異(14個(gè)月vs．11個(gè)月，p=0.714)，

10、EGFR基因野生型和突變型患者的中位TTP也沒(méi)有顯著差異(14個(gè)月VS．13個(gè)月，p=0.906)。 第2章肺癌細(xì)胞系的建立與鑒定及EGFR功能相關(guān)檢測(cè) 材料與方法 1、腫瘤細(xì)胞的分離培養(yǎng)： 分別采用從腫瘤組織中和從胸腹水中分離培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，從腫瘤組織中分離培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞采用酶消化法分離細(xì)胞，分離后濾網(wǎng)過(guò)濾后接種，從胸腹水中分離培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞則采用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞以減少間皮細(xì)胞的干擾。

11、2、腫瘤細(xì)胞系的鑒定： 當(dāng)腫瘤細(xì)胞系傳代超過(guò)60代后對(duì)其生長(zhǎng)特性進(jìn)行了鑒定，包括：細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制，染色體分析，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗(yàn)，動(dòng)物接種實(shí)驗(yàn)。 此外采用巢式PCR擴(kuò)增、瓊脂凝膠電泳純化后直接測(cè)序?qū)δ[瘤細(xì)胞系EGFR基因突變進(jìn)行檢測(cè)，利用FISH檢測(cè)了 EGFR基因拷貝數(shù)。 結(jié)果 腫瘤細(xì)胞系的鑒定：細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析顯示細(xì)胞倍增時(shí)間為27.1小時(shí)；細(xì)胞

12、染色體分析表明染色體數(shù)量為66～78，并具異常染色體核型；流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞周期分布為G1期占69.05％，G2期占11.32％，S期占19.63％；軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成率為27.3％。動(dòng)物接種后第7天腫瘤開(kāi)始形成。 腫瘤細(xì)胞的測(cè)序顯示3株腫瘤細(xì)胞系EGFR基因18、19和21外顯子均為野生型。EGFR基因拷貝數(shù)FISH檢測(cè)結(jié)果提示3株細(xì)胞系EGFR基因?qū)儆谄胶舛啾扼w型。其中2例患者接受EGFR-TKI治療療效較好。

13、 第3章 EGFR-TKl對(duì)肺癌細(xì)胞EGFR及其下游信號(hào)分子表達(dá)的影響 材料與方法： 采用MTT法檢測(cè)吉非替尼對(duì)腫瘤細(xì)胞系的殺傷，確定IC50的范圍；通過(guò)在細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境中加入適量吉非替尼阻斷細(xì)胞EGFR信號(hào)通路后，比較腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的變化；采用Trizol一部法提取腫瘤細(xì)胞的RNA后，利用Real-Time PCR檢測(cè)EGFR、raS及其下游信號(hào)通路MAPK、P13K／AKt重要分子表達(dá)的變化。對(duì)不同基因

14、的擴(kuò)增效率進(jìn)行檢測(cè)后，采用2-△△Ct法比較基因表達(dá)的差異。 結(jié)果 MTT法結(jié)果顯示吉非替尼在低濃度時(shí)即可對(duì)腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制，而IC50在4μM左右。 腫瘤生長(zhǎng)環(huán)境中加入吉非替尼后，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到了明顯的抑制，活力顯著下降，細(xì)胞出現(xiàn)死亡。 基因擴(kuò)增效率的測(cè)定顯示，幾個(gè)基因與內(nèi)參β-actin相比擴(kuò)增效率一致，可以應(yīng)用2-△△Ct法比較基因表達(dá)的差異。 結(jié)論

15、 1．對(duì)于中國(guó)NSCLC患者，EGFR基因突變的預(yù)測(cè)因子主要是病理類(lèi)型和吸煙狀況，性別并不能預(yù)測(cè)患者的EGFR突變情況； 2．腺癌、女性、非吸煙患者、EGFR突變型患者接受吉非替尼治療的療效較好； 3．吉非替尼對(duì)中國(guó)肺癌患者有效率為48.1％，高于中國(guó)人群EGFR基因突變 率的27.8％，提示存在影響吉非替尼療效的其它因素。 4．胸腹水中提取腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)可以作為腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)的一條重要途徑； 5

16、．細(xì)胞系EGFR基因野生型細(xì)胞系可以表現(xiàn)為EGFlR高拷貝數(shù)型，EGFR基因突變和EGFR基因的拷貝數(shù)增加之間并無(wú)一致性。 6．EGFR基因野生型但拷貝數(shù)增高的患者接受EGFR-TKI可以有較好的療效。 7．吉非替尼對(duì)原代培養(yǎng)細(xì)胞系的IC50為4gM。 8．吉非替尼在低濃度下對(duì)EGFR野生型而EGFR高拷貝數(shù)的肺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷作用； 9．吉非替尼對(duì)于EGFR野生型而EGFR高拷貝數(shù)的肺癌細(xì)胞的EGF

17、R和RAS基因表達(dá)無(wú)明顯影響； 10．吉非替尼對(duì)EGFR高拷貝數(shù)肺癌細(xì)胞的MAPK、P13K／Akt信號(hào)通路有顯著的抑制作用，和未抑制相比，MAPK為0.529倍，P13K為0.148倍，Akt為0.195倍。 11．EGFR基因高拷貝數(shù)與EGFR-TKI治療療效之間可能存在一定關(guān)系。 創(chuàng)新點(diǎn) 1、本研究大規(guī)模的檢NT中國(guó)NSCLC患者EGFR基因突變的分布情況，并提出性別并不能預(yù)測(cè)患者的EGFR突變情況