β-欖香烯乳對食管鱗狀癌細胞株（EC109）體外放射增敏作用的實驗研究.pdf

1、食管癌是消化道最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率為13/10萬，每年新增患者超過30萬人，并且大多數(shù)發(fā)生于發(fā)展中國家，在我國食管癌(esophageal cancer，EC)每年新增診斷病例約25萬，尤以我國北方太行山區(qū)發(fā)病率最高。死亡率為男性27.54/10萬，女性14.05/10萬，居癌癥死因第4位，是威脅人民身體健康的消化道惡性腫瘤之一。食管癌主要有鱗癌(squamous cell carcinoma，SCC)和腺癌(adenocarci

2、noma,ADC)兩種組織形式，它們的病因?qū)W和病理學(xué)特征有很大不同，我國食管癌占惡性腫瘤發(fā)病率的第四位，并且以鱗癌為主。圍手術(shù)期常輔以放療，如何提高食管磷狀癌細胞對放射線的敏感性，既能按計劃量照射，又能降低放療對正常組織的損傷，一直是我們追求的目標。研究顯示癌細胞凋亡增加，有更大的放射敏感性，有學(xué)者將腫瘤細胞凋亡水平作為腫瘤放射敏感性的衡量指標。很多學(xué)者都致力于探索增加細胞凋亡的方法，以期提高細胞對放射線的敏感性。處于分裂周期不同時相的

3、細胞其放射敏感性有很大的差異。放射生物學(xué)研究己證實，細胞周期中不同時相的細胞放射敏感性有很大差別，G<,2>后期和M期放射敏感性最高。因此，促使腫瘤G<,1>/S期細胞進人并停留在對放射線敏感的G<,2>/M期，是提高腫瘤放射敏感性、改善療效的一個重要途徑。 放射增敏劑是指能提高射線對癌細胞的殺傷力，而對受照射的正常細胞影響不大的一些物質(zhì)(化學(xué)合成藥物、中草藥及其有效成分、生物制品等)。從20世紀60年代初期，國內(nèi)外對放射增敏劑

4、進行了長期的研究,多種化學(xué)藥物曾被嘗試用作放射增敏劑，然而臨床效果不理想，并且普遍存在骨髓抑制等毒副反應(yīng)，如5-氟尿嘧啶是放療常用的化學(xué)增敏劑，但毒副反應(yīng)明顯，常出現(xiàn)胃腸道反應(yīng)。因此研究探索新的高效低毒增敏劑具有實用價值，我國中草藥資源十分豐富，而且蘊涵較大的研發(fā)潛力。β-欖香烯乳是從中藥莪術(shù)中提取出來的具有抗癌活性的國家二類抗癌新藥，對正常細胞及組織毒性非常低，副作用輕微，無明顯肝、腎功能損害，不發(fā)生骨髓抑制，不同于一般的細胞毒性化療

5、藥物。多項研究表明β-欖香烯乳對諸多腫瘤有抗癌效應(yīng)，下調(diào)bcl-2基因表達、誘導(dǎo)細胞凋亡、改變細胞周期分布是其主要抗癌機制。已有研究證明其可增加癌細胞對放射線的敏感性。本研究用低細胞毒性濃度β-欖香烯乳作用腫瘤細胞后，觀察欖香烯乳對食管磷狀癌細胞體外放射增敏作用，并探討其增敏機制，為臨床研究提供新思路和借鑒，為中藥放射增敏研究提供方法。 目的： 本課題旨在研究β-欖香烯乳對人食管鱗狀癌細胞放射敏感性的影響，并探討其相關(guān)機

6、制，著重解決以下問題：1、β-欖香烯乳是否增加人食管鱗狀癌細胞的放射敏感性及不同濃度一時間作用后的增敏效果如何。2、探討β-欖香烯乳放射增敏的機制。 材料與方法： 食管鱗狀癌細胞株(EC109)由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室保存，β-欖香烯乳由大連金港制藥集團有限責(zé)任公司生產(chǎn)，EC109細胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中。實驗組用含不同濃度(20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、120μg/m

7、L)β-欖香烯乳培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，設(shè)13一欖香烯乳空白對照組，然后在不同的照射劑量下照射(0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)。細胞在實驗設(shè)定的時間終止培養(yǎng)，用MTT法和集落形成法測定不同濃度β-欖香烯乳對細胞生長的抑制率；MTT法初步判斷其對EC109細胞的放射敏感性；集落形成法觀察β-欖香烯乳對EC109細胞的放射增敏作用；流式細胞術(shù)分析β-欖香烯乳作用前后細胞周期及凋亡變化；間接免疫熒光聯(lián)合流式細胞儀定量檢測凋亡調(diào)控蛋白Bcl-

8、2、Bax的表達變化：免疫細胞化學(xué)染色觀察Bcl-2、Bax蛋白表達變化。數(shù)據(jù)采用Spss10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析、t檢驗和趨勢卡方檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，多重比較采用Dunnett法、檢驗水準α為0.05。 結(jié)果： 1. β-欖香烯乳作用細胞24h后，低濃度20μg/mL反而促進細胞增殖，40μg/mL以上濃度，隨β-欖香烯乳濃度增加，細胞生長抑制率增加(P<0.05)。 2.不同照射量照

9、射經(jīng)0 μg/mL、40μg/mL β-欖香烯乳作用24h后的細胞，測OD值，結(jié)果40μg/mL組OD值均較空白組OD值減小。經(jīng)0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy照射后OD值從0.907±0.053、0.838±0.027、0.774±0.029、0.680±0.013、0.652±0.013分別降至0.800±0.009、0.680±0.009、0.562±0.009、0.454±0.009、0.345±0.009，統(tǒng)計學(xué)分析兩組

10、間有顯著性差異(P<0.05)。初步判斷β-欖香烯乳對EC109細胞有放射增敏作用。 3.不同照射劑量照射經(jīng)40μg/mL、60μg/mL β-欖香烯乳作用24小時后的細胞集落結(jié)果及存活率，與空白組比較均有顯著性差異(P<0.05)。40μg/mL、60μg/mL兩濃度組之間也有顯著性差異(P<0.05)。經(jīng)0Gy、2Gy、4Gy、、6Gy、8Gy照射后細胞集落數(shù)從88±2.65、74±2.65、55±2.65、48±3.61、

11、38±3.46分別減少至40 μg/mL組78±2.00、60±3.61、49±1.00、31±1.00及60μg/mL組71±2.65、53±1.73、43±2.65、25±5.00、13±3.61。集落形成法進一步證明：β-欖香烯乳在低細胞毒性濃度下對EC109細胞有放射增敏作用，隨濃度增加，放射增敏作用增強。 4.不同照射劑量照射經(jīng)60 μg/mL β-欖香烯乳作用48h后的細胞集落結(jié)果及存活率與60 μg/mL作用24h

12、有顯著性差異(P<0.05)。經(jīng)0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy照射后集落數(shù)從88±2.65、74±2.65、55±2.65、48±3.61、38±3.46分別減少至24h組78±2.00、60±3.61、49±1.00、39±2.65、31±1.00及48h組74±1.00、53±1.00、36±4.58、20±6.08、8±6.46。β-欖香烯乳在低細胞毒性濃度下對EC109細胞有放射增敏作用，隨作用時間增加，放射增敏作用增強

13、。 5.隨β-欖香烯乳濃度、作用時間的增加，EC109細胞的凋亡率有上升趨勢，由開始的0.1％升高到17.6％。統(tǒng)計學(xué)分析組間有顯著性差異(P<0.05)β-欖香烯乳作用后細胞凋亡率增加與濃度、作用時間成正相關(guān)。 6．β-欖香烯乳作用細胞后發(fā)生G<,2>/M期阻滯，相同時間下，藥物濃度越高，G<,2>/M期細胞比率越高，有上升趨勢。統(tǒng)計學(xué)分析組間有顯著性差異(P<0.05)。 7．60 μg/mL β-欖香烯乳作

14、用24h,細胞Bcl-2表達下降，著色減弱；定量結(jié)果顯示：相同時間，不同濃度β-欖香烯乳作用后，隨藥物濃度增加Bcl-2蛋白平均熒光強度減少(P<0.05)；同一藥物濃度，不同作用時間，隨作用時間增加，Bcl-2平均熒光強度也減少(P<0.05)。 8．60 μg/mL β-欖香烯乳作用24h，細胞Bax表達增加，細胞漿著色增強；定量結(jié)果顯示：相同時間，不同濃度β-欖香烯乳作用后，隨藥物濃度增加Bax蛋白表達增加(P<0.05)

15、；同一藥物濃度，不同作用時間，隨作用時間增加，Bcl．2蛋白表達也增加(P<0.05)。 結(jié)論： 1．40μg/mL ～120μg/mL β-欖香烯乳對EC109細胞有抑制作用，可阻滯細胞于G2/M期，與濃度成正相關(guān)，隨濃度增加，細胞生長抑制率增加。 2．β-欖香烯乳在低細胞毒性濃度下對．EC109細胞有放射增敏作用，且具有劑量和時間依賴性，并隨濃度的增加和時間延長，放射增敏作用增強。 3．β-欖香烯乳可