轉染人熱休克蛋白70基因（hHSP70）對大鼠同種異體移植血管病的影響.pdf

1、本研究采用顯微外科技術，成功建立大鼠頸部同種異體移植血管模型。以人熱休克蛋白70(hHSP70)基因為目的基因，重組5型腺病毒為載體，制備轉染液，對離體供血管進行外源性基因修飾，移植血管成功表達hHSP70基因。hHSP70基因表達產物能有效地增加移植血管SOD、NADPH氧化酶的活性，下調MPO的活性，抑制細胞的凋亡，明顯減輕移植血管的缺血再灌注損傷。腺病毒介導hHSP70基因轉染移植血管后表達基因產物，能夠下調黏附分子(ICAM-1

2、、VCAM-1)及其調節(jié)因子(NF-kB)的轉錄；抑制細胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α)的分泌；減少生長因子(PDGF，FGF，IGF-1)的表達；增加血管平滑肌細胞的凋亡。轉染人熱休克蛋白70(hHSP70)基因通過表達基因產物保護血管內皮細胞，抑制平滑肌細胞的增生和遷移，減輕各種免疫和非免疫因素的影響，對同種異體移植血管病有明顯的預防作用。充分發(fā)揮機體保護性基因的作用可成為預防同種異體血管病的一種新策略。 第一部分大

3、鼠同種異體移植血管病的動物模型的建立目的：研究建立大鼠同種異體移植血管病變模型，便于展開系列研究。方法SD大鼠為供體，Wistar大鼠為受體，采用顯微外科技術將供體的頸總動脈原位移植于受體大鼠。分別于術后1、7、14、21、28、35天摘取受體移植血管，觀察移植血管在活體的搏動情況，光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察移植血管的組織病理改變。結果：完成50例移植模型，成功率100％，均長期存活。平均手術時間45分鐘，吻合頸總動脈時間15分鐘。術后

4、1-3天主要出現內皮受損，功能下降及隨后的不同程度的修復，一周開始移植血管有明顯的病理改變，內皮再次受損，中層血管平滑肌細胞開始遷移和增殖；二周開始血管內膜增殖形成，至四周血管病變完全形成。五～六周時最明顯，管腔已基本堵塞，移植血管失去功能。結論：應用顯微外科技術成功建立同種異體移植血管模型，手術操作簡單，無明顯并發(fā)癥；SD和Wistar大鼠間的血管移植是符合同種異體移植血管的病理改變的，適用于心臟移植及其他器官移植術后血管病變的研究。

5、 第二部分腺病毒介導hHSP70基因轉染液的制備目的：研究腺病毒介導hHSP70基因轉染液的制備。方法通過pDC316-HSP70質粒的構建，利用雙質粒共轉染293細胞，同源重組產生重組腺病毒，經過毒種的鑒定，生產和純化，最后進行滴度測定。結果序列測定結果重組質粒pDC316-HSP70與GeneBank的登記序列一致，為人熱休克蛋白70基因，質粒構建正確，重組病毒攜帶HSP70基因。結論成功構建攜帶hHSP70基因的重組腺病毒

6、載體能在239細胞系中包裝成具有感染性的重組腺病毒，為其應用研究奠定基礎。 第三部分腺病毒介導hHSP70基因轉染對同種異體移植血管缺血再灌注損傷的影響目的：觀察腺病毒介導hHSP70基因轉染對大鼠同種異體移植血管缺血再灌注損傷的影響并探討其可能作用機制。方法總共40對大鼠，平均分為四組，(n=10)，A.假手術對照組；B.空白載體對照組；C.空白對照組；D.hHSP70基因轉染組。采取直接浸泡轉染法對供體血管進行外源性修飾，移

7、植后8小時切取移植血管，檢測hHSP70基因表達，觀察及測定移植血管損傷及保護效應指標。結果基因轉染組外源性hHSP70基因成功表達。與對照組比較，基因轉染組血管內皮細胞受損明顯減輕，凋亡明顯減少；炎癥細胞浸潤減弱；SOD及NADPH氧化酶的含量及活性升高(p<0.01)；MPO的含量及活性明顯下降(p(0.01)。結論”腺病毒介導的hHSP70基因能成功地轉染至局部移植血管并進行表達；hHSP70基因導入局部移植血管能有效地抑制移植血

8、管的缺血再灌注損傷。 第四部分腺病毒介導hHSP70基因轉染對同種異體移植血管病的影響目的：觀察腺病毒介導hHSP70基因轉染對同種異體移植血管病的影響及探討其可能作用機制。方法總共30對大鼠，平均分為三組：A.空白載體對照組，B.空白對照組，C.hHSP70基因轉染組。將供體血管浸泡在上述不同成分的肝素生理鹽水中30分鐘，隨后建立模型。術后35天切取血管進行基因表達及移植血管損傷的檢測。結果基因轉染組外源性hHSP70基因成功

9、表達。光鏡及電鏡下觀察基因轉染組與對照組比較，移植血管腔更為通暢，內皮細胞損傷小，中層平滑肌細胞增生減輕，計算機圖像分析系統(tǒng)分析移植動脈內膜與中層的比例減少；各種分子指標基因轉染組組與對照組比較，細胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α)的分泌抑制，生長因子(PDGF，FGF，IGF-1)的表達減少，黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)及其調節(jié)因子(NF-kB)的表達下調，TUNEL檢測平滑肌凋亡指數上升。 結論：腺病毒介導的