腦缺血大鼠血腦屏障和P-糖蛋白的變化以及清開靈有效組分的作用.pdf

1、對于缺血性腦血管病來說，尚無一療效突破性藥物能從根本上解決腦損傷問題。其主要原因之一是由于血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的阻擋，使得受損腦組織無法獲得有效的藥物濃度。因此，促進(jìn)有效藥物的腦部轉(zhuǎn)運(yùn)便成為一個(gè)亟待解決的關(guān)鍵問題。缺血性中風(fēng)屬中醫(yī)“絡(luò)病”范疇，“毒損腦絡(luò)”是其病機(jī)關(guān)鍵，臨床上從絡(luò)脈的功能特點(diǎn)入手進(jìn)行論治取得了顯著的療效。雖然絡(luò)脈不等同于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的微循環(huán)，但其結(jié)構(gòu)定位在很大程度上與西醫(yī)學(xué)的微循環(huán)相似。

2、從目前絡(luò)病生物學(xué)的基礎(chǔ)研究來看，微血管內(nèi)皮細(xì)胞在絡(luò)病的多個(gè)病理環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也日益認(rèn)識(shí)到，除結(jié)構(gòu)屏障外，由內(nèi)皮細(xì)胞上藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體所構(gòu)成的功能屏障在腦病治療中也具有重要作用。因此，我們在中醫(yī)絡(luò)脈理論的指導(dǎo)下，以有效開啟BBB轉(zhuǎn)運(yùn)功能以提高腦內(nèi)藥物濃度為切入點(diǎn)，研究清開靈有效組分腦部轉(zhuǎn)運(yùn)與BBB結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，并分析有效組分對P-糖蛋白功能表達(dá)的影響，從而開展中藥組分配伍以增加BBB主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能而發(fā)揮腦保護(hù)作用的研究。

3、 目的： 通過對正常大鼠不同時(shí)段腦脊液及血清中清開靈主要有效組分進(jìn)行分析與對比，尋找清開靈有效組分進(jìn)入腦組織的特征。同時(shí)通過觀察腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)BBB的形態(tài)變化和P-糖蛋白的功能變化，以及分析藥物組分對P-糖蛋白表達(dá)與功能的影響，尋找清開靈有效組分腦部轉(zhuǎn)運(yùn)與BBB形態(tài)及功能變化的關(guān)系，初步揭示清開靈有效組分透過缺血性腦損傷BBB的配伍效應(yīng)。 方法： 1．觀察清開靈主要有效組分透過正常大鼠BBB的情況：

4、以清開靈注射液中梔子苷、黃芩苷、膽酸和去氧膽酸作為體內(nèi)樣品分析的載體，利用現(xiàn)代分析手段——多維指紋圖譜技術(shù)測定不同時(shí)間點(diǎn)清開靈有效組分在正常大鼠腦脊液和血清中的含量變化。 2．觀察正常和缺血性腦損傷大鼠BBB的形態(tài)學(xué)變化：制作腦組織HE染色切片和超薄切片，利用光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察正常和缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)BBB形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化以及腦組織損傷的情況。 3．觀察腦缺血再灌注損傷大鼠BBB P-糖蛋白表達(dá)的時(shí)序特征：利

5、用蛋白免疫印跡和免疫組織化學(xué)的方法，分析P-糖蛋白在腦缺血再灌注后表達(dá)的時(shí)序性特征；同時(shí)利用免疫電鏡方法進(jìn)行P-糖蛋白的超微結(jié)構(gòu)定位，從一定程度上反映由于蛋白功能表達(dá)的改變而可能引起的藥物腦部轉(zhuǎn)運(yùn)的變化。 4．清開靈有效組分對大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞P-糖蛋白功能和表達(dá)的影響：首先成功培養(yǎng)和鑒定大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，然后分別利用CCK8細(xì)胞活性檢測法和蛋白免疫印跡法，分析清開靈有效組分對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上P-糖蛋白功能和表達(dá)的影響。

6、 5．清開靈有效組分對正常及腦缺血再灌注損傷大鼠BBB形態(tài)結(jié)構(gòu)和P-糖蛋白表達(dá)的影響：制作腦組織HE染色切片和超薄切片，利用光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察清開靈有效組分對正常及腦缺血再灌注損傷大鼠BBB形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，采用免疫組織化學(xué)方法分析P-糖蛋白的表達(dá)情況，結(jié)構(gòu)與功能相結(jié)合分析清開靈有效組分透過BBB的協(xié)同配伍效應(yīng)。 結(jié)果： 1．在正常大鼠腦脊液和血清樣品中均可檢出梔子苷，說明梔子苷透過了BBB。同時(shí)，梔子

7、苷呈現(xiàn)相同的積累和消除趨勢，達(dá)峰時(shí)間均在給藥后0.2-0.5小時(shí)，其中在腦脊液中樣品的達(dá)峰時(shí)間稍有拖后，在0.5小時(shí)左右，說明梔子苷透過BBB集中于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中需要一些時(shí)間。而黃芩苷、膽酸和去氧膽酸未能在腦脊液中檢出，說明三者可能均無法透過BBB。但膽酸作為內(nèi)源性物質(zhì)，在3小時(shí)產(chǎn)生雙峰現(xiàn)象，這可能是由于體內(nèi)代償性膽酸分泌所致。 2．動(dòng)態(tài)觀察缺血再灌注損傷狀態(tài)下BBB的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，再灌注的時(shí)間與BBB通透性的變化密切相關(guān)。再灌

8、注0小時(shí)和0.5小時(shí)，微血管管周間隙變大，開始出現(xiàn)水腫，內(nèi)皮細(xì)胞輕度腫脹，但此時(shí)：BBB的緊密連接未完全開放，機(jī)體處于代償階段，通透性略有增加。再灌注2小時(shí)和6小時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞空泡化明顯，有炎細(xì)胞浸潤，說明此階段內(nèi)皮細(xì)胞膜通透性開始增大，同時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞的足突與微血管基底膜分離程度漸大，此時(shí)BBB通透性在進(jìn)一步增大。再灌注12小時(shí)和24小時(shí)，由于BBB的各組成結(jié)構(gòu)均發(fā)生了嚴(yán)重?fù)p害，可觀察到此階段三層結(jié)構(gòu)都有很大程度破壞，故此時(shí)BBB通

9、透性應(yīng)該最大。到再灌注48小時(shí)和72小時(shí)，缺血區(qū)多數(shù)血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)不完整，但管周間隙變小，水腫有所減輕，以72小時(shí)顯著。但大量的神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞壞死、崩解，并可見腦組織中大量的小膠質(zhì)細(xì)胞，提示組織的修復(fù)已經(jīng)開始，故BBB通透性在一定程度上有所降低，以72小時(shí)更顯著。 3．通過兩種檢測手段發(fā)現(xiàn)，P-糖蛋白表達(dá)量的變化可分三個(gè)階段：第一階段(再灌注Oh-6h)與正常組相比P-糖蛋白表達(dá)量下降到最低。因再灌注早期損傷進(jìn)一步加重，大

10、量釋放的炎癥介質(zhì)引起內(nèi)皮細(xì)胞的損傷；同時(shí)P-糖蛋白的表達(dá)量驟減，導(dǎo)致BBB外排功能減弱。其中再灌注1/2小時(shí)可能由于機(jī)體的代償引起蛋白表達(dá)量的回升，但很快又回落到最低點(diǎn)。第二階段(再灌注12h-72h)蛋白表達(dá)量逐漸增加。P-糖蛋白的增加較BBB結(jié)構(gòu)恢復(fù)來得更快，新合成的P-糖蛋白會(huì)很快裝配到細(xì)胞膜上，來代償因結(jié)構(gòu)破壞而導(dǎo)致的BBB通透性的增加，發(fā)揮外排有害物質(zhì)維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。第三階段(再灌注4d-10d)P-糖蛋白的表達(dá)量明顯

11、增多而幾乎接近正常。第4天由于內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯分裂增生出現(xiàn)修復(fù)，致使P-糖蛋白的表達(dá)量驟增。P-糖蛋白表達(dá)水平的變化從一定程度上可以反映其功能的改變。 4．無論是正常還是缺血損傷的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，當(dāng)長春新堿(VCR)濃度為10nM和20nM時(shí)，梔子苷與膽酸均能對抗VCR的細(xì)胞毒作用，提高內(nèi)皮細(xì)胞活性。綜合陽性藥維拉帕米的作用，我們推測梔子苷與膽酸可能是通過增強(qiáng)P-糖蛋白的外排功能，使VCR大量被泵出細(xì)胞外，從而保

12、護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷。而當(dāng)VCR濃度達(dá)到30nM時(shí)，兩者則無法對抗其毒性作用，可能是由于VCR濃度過高致使細(xì)胞毒作用過強(qiáng)所致。通過研究清開靈有效組分對P-糖蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)梔子苷對該蛋白的表達(dá)幾乎沒有影響；而令我們感到意外的是，膽酸則通過提高P-糖蛋白的表達(dá)量使VCR大量外排，提高了細(xì)胞活性。但黃芩苷和清開靈在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中并沒發(fā)揮對抗VCR的作用，未能起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。并且在模型組中，VCR+清開靈反而加重了細(xì)胞損傷，說明清開靈在

13、此種條件下可能具有一定的毒性作用。 5．正常用藥組中除黃芩苷外，其他有效組分對BBB結(jié)構(gòu)均無顯著影響-：三層結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)皮細(xì)胞和足突無水腫，微血管管周無明顯間隙。只有黃芩苷組血管周圍間隙略有增大，出現(xiàn)水腫征象，考慮黃芩可能在一定程度上能增大BBB的通透性。而對于模型用藥組來說，三個(gè)有效組分單獨(dú)使用對水腫現(xiàn)象的改善并不十分明顯，但清開靈組卻使微血管周圍間隙明顯變小，水腫獲得減輕，微血管未見扭曲變形，管周組織損傷減輕。所以與其他用藥

14、組相比，清開靈可顯著減輕腦水腫，并降低BBB的通透性，起到雙重保護(hù)的作用。 結(jié)論： 1．清開靈的四種主要有效組分梔子苷、黃芩苷、膽酸和去氧膽酸在血清中的經(jīng)時(shí)變化規(guī)律是隨時(shí)間延長而濃度漸低，其中只有梔子苷可透過正常BBB，在腦脊液中的達(dá)峰時(shí)間與血清相比略有延遲。而其他藥物組分有可能通過影響B(tài)BB的結(jié)構(gòu)與功能而增加梔子苷的腦部轉(zhuǎn)運(yùn)。 2．缺血再灌注早期，P-糖蛋白表達(dá)與BBB形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化趨勢相反，前者的變化程度較后

15、者更為明顯，BBB通透性開始增加。中期，兩者變化趨勢仍相反，組織結(jié)構(gòu)還未獲得明顯的修復(fù)，而功能蛋白的合成己不斷增加。由于組織結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，所以新合成的功能蛋白難以彌補(bǔ)結(jié)構(gòu)屏障的破壞，此期BBB通透性進(jìn)一步增加。晚期，兩者共同正向變化，BBB通透性降低。由此可見，缺血再灌注狀態(tài)下BBB結(jié)構(gòu)與功能的改變與再灌注時(shí)間密切相關(guān)。BBB超微結(jié)構(gòu)的改變不僅增加了治療藥物的漏過，而且使得血中有害物質(zhì)大量入腦，引起腦組織損傷。所以，在改善和重建BBB形

16、態(tài)結(jié)構(gòu)和降低其通透性的前提下，有效開啟BBB轉(zhuǎn)運(yùn)功能以增加有效藥物組分的腦部轉(zhuǎn)運(yùn)，才是治療腦部疾患的根本途徑。 3．清開靈有效組分在透過正常及缺血性腦損傷BBB中具有協(xié)同配伍效應(yīng)，各組分的作用靶點(diǎn)各有側(cè)重。黃芩苷可能引起微血管通透性的增強(qiáng)；梔子苷不僅可以有效減輕腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，而且可以透過BBB直接保護(hù)受損神經(jīng)元；而膽酸通過增強(qiáng)P-糖蛋白的表達(dá)來外排有害物質(zhì)入腦，減輕BBB破壞造成的腦損傷；清開靈則可明顯減輕腦水腫。所以

17、，以上作用特點(diǎn)從另一層面揭示了清開靈“解毒通絡(luò)”的作用機(jī)制；同時(shí)也表明，從中藥有效組分配伍應(yīng)用來尋求高效低毒的外排轉(zhuǎn)運(yùn)體逆轉(zhuǎn)劑可以為腦病治療藥物的研發(fā)開辟出一條更有效的途徑。 4．清開靈治療缺血性腦損傷具有良好的療效，其效果的取得與有效組分透過BBB及影響B(tài)BB的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。中藥配伍應(yīng)用發(fā)揮多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的保護(hù)作用，既對損傷BBB結(jié)構(gòu)有改善和重建作用，又可通過影響藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體而提高有效組分的腦內(nèi)濃度并改善腦神經(jīng)的功能。這種