P190蛋白在維系血腦屏障功能中的作用.pdf

1、背景及目的
　　 P190蛋白是一種神經(jīng)元跨膜蛋白,由1384個氨基酸組成。最初發(fā)現(xiàn)于有髓神經(jīng)纖維郎飛氏節(jié)的節(jié)旁側(cè),主要在脊椎動物腦內(nèi)表達(dá),另外在卵巢、胰臟、腸、肺、心臟及睪丸等組織內(nèi)也有少量表達(dá)。P190蛋白與髓鞘蛋白NF155等結(jié)合,在神經(jīng)軸突的節(jié)旁側(cè)形成節(jié)旁連接(Paranodal junction),這種連接結(jié)構(gòu)類似于間隔連接(Septate junction)。間隔連接廣泛存在于果蠅等無脊椎動物的血-神經(jīng)屏障處,與脊椎

2、動物血腦屏障處的緊密連接功能類似。目前研究表明,脊椎動物內(nèi)由P190、NF155等蛋白形成的節(jié)旁連接在維持神經(jīng)沖動的跳躍式傳導(dǎo)、軸突.膠質(zhì)細(xì)胞間信息快速傳遞、軸突特化區(qū)域的形成及軸-膠間隙與細(xì)胞外基質(zhì)間屏障形成中發(fā)揮重要作用。P190蛋白表達(dá)異?？僧a(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂,P190-/-型小鼠的神經(jīng)沖動傳導(dǎo)速度明顯低于正常小鼠,而且在出生后不久即因神經(jīng)元變性壞死而導(dǎo)致死亡。另外有研究顯示多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosi

3、s,MS)患者腦內(nèi)P190表達(dá)水平明顯降低。P190表達(dá)降低可進(jìn)一步導(dǎo)致髓鞘脫離軸突,促進(jìn)軸突變性壞死,進(jìn)而形成神經(jīng)元變性損傷的惡性循環(huán)。在糖尿病性神經(jīng)病變的大鼠中,P190的表達(dá)水平也明顯降低。由此可見,P190蛋白的功能是至關(guān)重要的,但其具體功能和作用機(jī)制還不清楚。
　　 血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)是由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、基膜及周細(xì)胞等共同組成的高度特化的神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)單元。其中腦微

4、血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接和粘附連接是構(gòu)成血腦屏障結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ),也是維持血腦屏障功能的關(guān)鍵。目前已知的內(nèi)皮細(xì)胞間連接相關(guān)蛋白已有很多,包括跨膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白；同時對內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接和粘附連接的作用機(jī)制也有了深入認(rèn)識,但仍有待發(fā)現(xiàn)更多的連接蛋白及更深入的了解內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能機(jī)制。
　　 我室研究人員發(fā)現(xiàn)P190蛋白除了在神經(jīng)軸突有表達(dá)外,在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human brain microvaseular endothe

5、lial cell,HBMEC)內(nèi)也有大量表達(dá),而且表達(dá)的P190蛋白在細(xì)胞間連接處有聚集的傾向?；诖?本研究通過構(gòu)建P190蛋白的一系列突變體作為基礎(chǔ),進(jìn)一步檢測P190顯性缺失突變對HBMEC功能的影響；同時利用酵母雙雜交的方法,篩選與P190蛋白的胞內(nèi)段互作的蛋白,期望找出P190對內(nèi)皮細(xì)胞功能作用的機(jī)制。
　　 方法
　　 1、根據(jù)已有的P190全長基因序列,利用重疊PCR的方法獲得P190不同結(jié)構(gòu)域缺失的基因

6、序列,克隆至真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA 3.1/myc-His B上,并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至第26代人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)中,Western blot法驗(yàn)證陽性細(xì)胞株。
　　 2、體外血管形成實(shí)驗(yàn)檢測P190不同結(jié)構(gòu)域缺失突變對HBMEC形成血管的能力是否有影響。
　　 3、懸滴聚集實(shí)驗(yàn)(Hanging-drop aggregation assay)檢測P190不同結(jié)構(gòu)域缺失突變對HBMEC的細(xì)胞間黏附力是否有影響。

7、r>　　 4、用HRP通透性實(shí)驗(yàn),檢測P190不同結(jié)構(gòu)域缺失突變對HBMEC形成的細(xì)胞單層的通透性是否有影響。
　　 5、利用蛋白質(zhì)免疫印跡的方法檢測P190不同結(jié)構(gòu)域缺失突變對HBMEC的緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和黏附連接蛋白VE-cadherin的表達(dá)是否有影響。
　　 6、利用細(xì)胞免疫熒光方法檢測P190不同結(jié)構(gòu)域缺失突變對HBMEC胞間連接結(jié)構(gòu)及對ZO-1和VE-cadherin的分布是否有影響。
　　

8、 7、利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選人胎腦文庫中與P190胞內(nèi)段互作的蛋白,并用GST-pull down法進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果
　　 1、成功獲得P190不同結(jié)構(gòu)域缺失的基因序列,經(jīng)測序驗(yàn)證后,成功轉(zhuǎn)染至人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,獲得相應(yīng)的細(xì)胞株。
　　 2、體外血管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,P190不同結(jié)構(gòu)域缺失突變對HBMEC的血管形成能力無影響。
　　 3、懸滴聚集實(shí)驗(yàn)表明,P190胞內(nèi)段缺失突變的內(nèi)皮細(xì)胞其細(xì)胞間黏

9、附力明顯低于對照組細(xì)胞。
　　 4、HRP通透性實(shí)驗(yàn)表明,P190胞內(nèi)段缺失型內(nèi)皮細(xì)胞對HRP的通透性明顯高于對照組細(xì)胞,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而SH3或band4.1結(jié)構(gòu)域分別缺失的內(nèi)皮細(xì)胞與對照組細(xì)胞相比,通透性無明顯變化。
　　 5、Western blot結(jié)果顯示,細(xì)胞連接蛋白ZO-1和VE-cadherin在各種突變型細(xì)胞和對照組細(xì)胞內(nèi),表達(dá)水平趨于一致。
　　 6、免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對照組細(xì)胞和SH3、

10、band4.1結(jié)構(gòu)域缺失的內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)較完整,緊密連接蛋白ZO-1和黏附連接蛋白VE-cadherin在細(xì)胞間連接處呈連續(xù)的線狀分布；而P190胞內(nèi)段全部缺失的內(nèi)皮細(xì)胞,細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)破裂不完整,而且ZO-1和VE-cadherin在細(xì)胞間連接處呈點(diǎn)狀或交錯的刺狀分布。
　　 7、酵母雙雜交法篩選得到14個陽性克隆,根據(jù)文獻(xiàn)資料選擇ATP1B3進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)論
　　 人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中P190