紅花黃酮成分抗血小板作用和作用機(jī)理研究.pdf

1、紅花(CarthamustinctoriusL.)為菊科紅花屬植物紅花的干燥花。該藥為最常用的活血化瘀中藥之一，常用于治療冠心病，心絞痛，腦血栓等心腦血管疾病。二十世紀(jì)中期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)紅花的化學(xué)成分及其作用機(jī)理進(jìn)行了大量研究。研究結(jié)果表明，紅花含黃酮、生物堿、脂肪酸類等化學(xué)成分，其中黃酮類成分為其主要水溶性成分，而紅花在臨床上主要以水煎液入藥，故對(duì)其水溶性成分的研究十分重要。研究結(jié)果表明，紅花提取物具抗血栓、抗心肌缺血、擴(kuò)張血管及降血

2、脂等多方面的藥理作用，但由于缺乏化學(xué)與藥理學(xué)研究手段的結(jié)合，以往紅花藥理研究所用的受試藥物多為紅花粗提物或雜質(zhì)含量較高的紅花黃色素(SafflorYellow，SY)，這些結(jié)果對(duì)說(shuō)明紅花有效部位藥效的客觀性較差，因此應(yīng)以化學(xué)與藥理學(xué)手段相結(jié)合進(jìn)行研究，探索紅花的有效部位及有效單體，并研究其作用機(jī)理。 SY是紅花主要水溶性組份，為多種查爾酮苷混合物，羥基紅花黃色素A(HydroxysaffloryellowA，HSYA)為SY中含

3、量較高的成分，本研究以HSYA做對(duì)照品，采用分光光度法對(duì)SY進(jìn)行定量，對(duì)不同產(chǎn)地商品紅花中SY含量進(jìn)行了測(cè)定，選擇最佳產(chǎn)地的紅花藥材制備SY，并為紅花質(zhì)控提供一簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的方法。本研究受試藥物SY為硅膠吸附法制備(簡(jiǎn)稱SY)，經(jīng)初步研究發(fā)現(xiàn)其抗血小板活化因子(PlateletActivatingFactor，PAF)活性較市售食品色素SY(簡(jiǎn)稱FSY)強(qiáng)，目前市售FSY為水提醇沉法制備，雜質(zhì)含量較高，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討S

4、Y的抗血小板與抗凝血作用，并與FSY進(jìn)行藥效平行比較，初步探索其作用機(jī)制。我室曾報(bào)道硅膠吸附法制備的SY可競(jìng)爭(zhēng)性抑制氚標(biāo)記的PAF與血小板受體的特異性結(jié)合，抑制PAF誘發(fā)的家兔血小板聚集、5-HT釋放及血小板內(nèi)游離鈣濃度的升高，提示SY為紅花水溶性抗PAF的有效部位。然而，SY為一混合組分，為進(jìn)一步探討紅花活血化瘀的作用機(jī)理，我們觀察了HSYA對(duì)[3H]PAF與家兔血小板受體特異性結(jié)合的影響，觀察該藥對(duì)PAF介導(dǎo)的家兔血小板及多型核白細(xì)

5、胞聚集作用的影響，試圖闡明該化合物為一新的PAF受體拮抗劑。 楊梅素(Myricetin，Myr)，化學(xué)名稱為3，5，7，3'，4'，5'-六羥基黃酮，是黃酮醇類化合物，為我研究室首次從紅花醇提物中分離鑒定，我室曾報(bào)道Myr等幾種紅花醇提物具抗PAF的作用，可抑制PAF介導(dǎo)的兔血小板聚集、5-HT釋放及血小板內(nèi)鈣離子濃度升高，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其抗PAF作用比HSYA強(qiáng)。本研究觀察了Myr對(duì)[3H]PAF與兔血小板受體特異性結(jié)合作用

6、的影響，觀察該藥對(duì)PAF介導(dǎo)的家兔血小板的黏附及多型核白細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高的影響，試圖闡明Myr為一紅花抗PAF的有效成分。本研究以化學(xué)與藥理學(xué)手段相結(jié)合進(jìn)行，以整體、細(xì)胞及分子水平的實(shí)驗(yàn)探索紅花活血化瘀的有效部位及有效單體，并研究其作用機(jī)理，試圖為紅花制劑的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。主要實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果如下： 1分光光度法測(cè)定紅花黃色素的含量本研究以大孔樹(shù)脂-葡聚糖凝膠柱層析法制備HSYA，分光光度法測(cè)定SY檢測(cè)波長(zhǎng)

7、選擇403nm，以HSYA為對(duì)照品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定并計(jì)算紅花水提液中紅花黃色素的含量。HSYA在10.8～75.6×10-3mg·ml-1線性關(guān)系良好，回歸方程Y=0.0120+37.2X(r=0.9999)。紅花樣品測(cè)定三次，批內(nèi)變異分別為RSD1.93％，1.63％，1.64％，n=10，批間變異為RSD1.44％，n=3。對(duì)照品加入0.0258mg，0.0516mg，0.0774mg時(shí)，回收率分別為98.0％，98.5％，101

8、.4％，n=5。產(chǎn)于河南、四川、新疆吉木薩爾縣及山東的商品紅花中SY含量為5.01～7.21％，其中新疆吉木薩爾縣紅花SY含量最高。 2硅膠吸附法制備的紅花黃色素SY延長(zhǎng)小鼠出血時(shí)間的作用本研究觀察了硅膠吸附法制備的紅花總黃色素(簡(jiǎn)稱SY)抗凝血及抑制血栓形成的作用，并與市售食品SY(簡(jiǎn)稱FSY)進(jìn)行藥效比較；以小鼠尾尖出血時(shí)間試驗(yàn)觀察SY灌胃對(duì)出血時(shí)間的影響，以比濁法測(cè)定兩種SY對(duì)家兔洗滌血小板聚集作用的影響、對(duì)家兔血漿凝血酶

9、原時(shí)間(PT)的影響。結(jié)果表明小鼠灌胃SY可明顯延長(zhǎng)尾尖出血時(shí)間(與NS對(duì)照組比較，**P＜0.05，***P＜0.01.)；體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SY可明顯抑制ADP誘導(dǎo)的家兔血小板聚集，延長(zhǎng)家兔血漿PT(與H2O對(duì)照管比較，**P＜0.01，或***P＜0.001.)，且SY均比FSY活性強(qiáng) 3HSYA對(duì)血小板活化因子的拮抗作用以放射配基受體結(jié)合試驗(yàn)觀察HSYA對(duì)[3H]PAF與家兔洗滌血小板(WRP)受體特異性結(jié)合的影響，以比

10、濁法觀察HSYA對(duì)PAF介導(dǎo)的WRP及兔多型核白細(xì)胞(PMN)聚集的影響，結(jié)果表明HSYA可濃度依賴地抑制1，2及4nmol·L-1[3H]PAF與WRP受體的結(jié)合；抑制PAF介導(dǎo)的WRP及兔PMN聚集，其IC50分別為0.99及0.70mmol·L-1，與空白對(duì)照管比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(**P＜0.05，**P＜0.01，或***P＜0.001.) 4楊梅素對(duì)血小板活化因子的拮抗作用以放射配基受體結(jié)合試驗(yàn)觀察[3H]PAF與家

11、兔血小板受體特異性結(jié)合的作用；以分光光度法測(cè)定PAF誘發(fā)兔血小板黏附的強(qiáng)度；以Fura-2熒光分光光度法測(cè)定PAF引發(fā)的兔多形核白細(xì)胞(PMN)內(nèi)鈣離子濃度的升高。結(jié)果表明，楊梅素可濃度依賴地抑制1、2、4nmol·L-1[3H]PAF與血小板受體的特異性結(jié)合，其IC50分別為34.8、85.7、118.6μmol·L-1，該藥可明顯抑制PAF誘發(fā)的兔血小板黏附及PMN內(nèi)游離鈣濃度的升高，其抑制血小板黏附的IC50為13.1μmol·L

12、-1，與對(duì)照管比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(**P＜0.05，**P＜0.01，或***P＜0.001.)。 基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以得出以下結(jié)論：1.分光光度法測(cè)定紅花黃色素含量是一種簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定性、重復(fù)性較好的方法，適于紅花生藥的質(zhì)量控制。 2.經(jīng)硅膠柱層析除雜質(zhì)制備的SY明顯較市售FSY藥效強(qiáng)。 3.紅花黃色素為紅花活血化瘀的有效部位，羥基紅花黃色素A及楊梅素均為紅花抗PAF的有效成分。 4.