Pirh2與肝癌的相關(guān)性分析及其互作蛋白AIG1和TD26的功能研究.pdf

1、本論文分兩部分，第一部分對(duì)Pirh2的生物學(xué)功能及其與原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌)的相關(guān)性進(jìn)行初步分析；第二部分對(duì)Pirh2相互作用蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行了初步研究。
　　本實(shí)驗(yàn)室在利用酵母雙雜交篩選能夠與hNTKL-BP1相互作用的蛋白時(shí)，得到了Pirh2的一種新剪接本(Pirh2b)。兩種剪接本所編碼的蛋白質(zhì)Pirh2a和Pirh2b具有不同的C端結(jié)構(gòu)，都可以同p53發(fā)生相

2、互作用，但體外泛素化實(shí)驗(yàn)表明Pirh2b并不具有泛素連接酶活性。10對(duì)肝癌組織樣本的RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明Pirh2在肝癌組織樣本和癌旁組織樣本中存在表達(dá)差異。為了進(jìn)一步研究Pirh2與肝癌的相關(guān)性，我們針對(duì)79例肝癌的組織樣本進(jìn)行了real-time RT-PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明Pirh2a在42例樣本中呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，占整個(gè)樣本數(shù)的53％，在16例樣本中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，占整個(gè)樣本數(shù)的20％，在21例樣本中不存在表達(dá)差異；Pirh2b在41例

3、樣本中呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，占整個(gè)樣本數(shù)的52％，在28例樣本中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，占整個(gè)樣本數(shù)的35％，在其余10例樣本中不存在表達(dá)差異。為了進(jìn)一步驗(yàn)證real-time RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們利用Pirh2的多克隆抗體對(duì)190例肝癌病例進(jìn)行組織芯片實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明Pirh2在正常肝組織中的表達(dá)水平(73％positive，139 of190tissues，P=1.839×10-11)明顯高于其在肝癌組織(38％ positive，74 of1

4、90tissues)的表達(dá)水平。我們結(jié)合病例資料對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了多種統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明Pirh2a的下調(diào)表達(dá)與腫瘤分化程度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：在低分化的肝癌樣本中下調(diào)表達(dá)更明顯。
　　為了進(jìn)一步研究Pirh2b的生物學(xué)功能，我們利用酵母雙雜交方法篩選出了其相互作用蛋白AIG1(Androgen induced1)和TD26(hepatocellular carcinoma，associated gene TD26)。生物信息學(xué)分析顯

5、示AIG1含有一個(gè)信號(hào)肽和6個(gè)疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域，我們進(jìn)行的細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)顯示AIG1呈繞核分布。生物信息學(xué)分析顯示TD26可能存在一個(gè)信號(hào)肽，可能是一種新的分泌蛋白。我們用酵母雙雜交、GSTPull-down、免疫共沉淀和細(xì)胞內(nèi)共定位的方法驗(yàn)證了Pirh2b與AIG1、Pirh2b與TD26之間特異性相互作用，同時(shí)也證明Pirh2a分別與AIG1和TD26同樣存在著特異性的相互作用。由于Pirh2a是一個(gè)具有泛素連接酶E3活性的蛋白，因此

6、這些結(jié)果提示AIG1和TD26有可能作為Pirh2a的兩個(gè)新的泛素化底物。我們通過(guò)體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)Pirh2可以直接或間接的促進(jìn)TD26蛋白的蛋白酶體降解。此外，我們利用real-time RT PCR的方法對(duì)AIG1和TD26與HCC的相關(guān)性進(jìn)行研究，結(jié)果同樣表明這兩個(gè)基因在癌組織中呈現(xiàn)明顯的下調(diào)表達(dá)。Kaplan-Meier方法分析表明AIG1與病人的術(shù)后生存期之間存在著明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AIG1下調(diào)表達(dá)越明顯的病人術(shù)后生存期越

7、短。而統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明TD26的下調(diào)表達(dá)與腫瘤分化程度之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：在低分化的肝癌樣本中下調(diào)表達(dá)更明顯。為了進(jìn)一步探尋Pirh2與AIG1和TD26相互作用的生物學(xué)意義，我們對(duì)AIG1和TD26進(jìn)行細(xì)胞信號(hào)通路的篩選實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)AIG1，可以明顯激活NFAT-PKC信號(hào)通路，這對(duì)Pirh2與AIG1相互作用可能的生物學(xué)意義提供了線(xiàn)索；在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TD26，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)生改變。組織表達(dá)譜分析顯示TD2

8、6在肝臟中明顯高表達(dá)，在腎臟，胰腺中有微弱的表達(dá)，而在腦，心臟，胎盤(pán)，肺和骨骼肌中沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)。
　　本論文首次對(duì)Pirh2與肝癌的相關(guān)性進(jìn)行了研究，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)了Pirh2在肝癌組織中無(wú)論轉(zhuǎn)錄水平，還是蛋白水平都呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，這不同于其在肺癌和前列腺癌中的表達(dá)情況，提示Pirh2可能是一種在肝癌中特異性下調(diào)表達(dá)的基因。同時(shí)篩選出兩個(gè)新的與Pirh2相互作用蛋白，并對(duì)這兩個(gè)蛋白同肝癌的相關(guān)性和可能參與的信號(hào)傳導(dǎo)通路以及對(duì)細(xì)胞周期