Cbl-b通過EGFR-SRC-AKT信號通路調(diào)節(jié)5-FU抑制胃癌細胞增殖的機理研究.pdf

1、前言
　　胃癌在世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，目前主要的治療手段包括外科手術和化療。對于不可手術的患者，化療能夠延長生存期和提高生活質(zhì)量。然而，進展期胃癌患者的預后仍然是很不理想的。此外，細胞毒化療藥物的副作用常常導致進展期胃癌患者生活質(zhì)量下降。因此，為了提高臨床治療效果，需要更多有效的可耐受的治療方案。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)廣泛應用于包括胃癌在內(nèi)的實體腫瘤的治療。但胃癌患者對5-FU的敏感性非常

2、有限。因此，有必要進一步研究5-FU作用的機制及如何提高5-FU的療效。目前已經(jīng)深入探討了在腫瘤治療方面如何提高腫瘤細胞對化療藥物誘導凋亡敏感性的方案，近期的研究顯示EGFR/SRC/AKT信號通路與5-FU的敏感性有關，提示調(diào)節(jié)EGFR/SRC/AKT信號通路的蛋白可能對5-FU的敏感性有一定的影響。
　　Cbl作為E3泛素連接酶發(fā)揮作用，它的RING辛指節(jié)構(gòu)募集E2連接酶，而它的Src同源區(qū)域識別被泛素化的靶蛋白。Cbl-b是

3、Cbl家族成員之一，在造血細胞大量表達，研究顯示Cbl-b能通過抑制細胞表面受體及其下游信號通路的激活而負性調(diào)節(jié)T細胞、B細胞和主細胞的活化以及白血病發(fā)生。Feng等的研究表明，PI3K的調(diào)節(jié)亞單位p85也是Cbl-b的作用底物，Cbl-b以蛋白酶解非依賴的方式負性調(diào)節(jié)p85。Cbl-b（-/-）cells存在AKT的高度活化及晚期T細胞的異常增殖。我們先前的研究表明，化療藥物如依托鉑苷、表阿霉素、柔紅霉素及三氧化二砷能上調(diào)白血病細胞C

4、bl-b的表達，Cbl-b通過抑制PI3K/AKT信號通路增加化療敏感性。我們近期的研究結(jié)果進一步證實Cbl-b提高5-FU誘導胃腺癌多藥耐藥細胞SGC7901/ADR的化療敏感性。盡管還沒有直接的證據(jù)，這些資料表明Cbl-b可能通過EGFR/SRC/AKT信號通路參與調(diào)節(jié)胃癌細胞對5-FU的敏感性。因此，綜合文獻報道，我們提出如下推測:Cbl-b通過促進EGFR、SRC和AKT等的泛素化，下調(diào)EGFR、SRC和AKT等的活化，使增殖信

5、號傳導減弱，從而協(xié)同5-FU抑制胃癌細胞增殖，Cbl-b可能對抑制人類腫瘤細胞包括胃癌細胞的增殖，提高化療敏感性起到關鍵的作用。
　　本研究以人胃癌細胞株MGC-803、BGC-823和SGC-7901為研究對象，進行如下研究:觀察5-FU對3種胃癌細胞系的增殖抑制作用;研究5-FU作用胃癌MGC803細胞是否存在EGFR、SRC、AKT等蛋白表達的變化，以及是否存在Cbl-b蛋白表達的變化;探討轉(zhuǎn)染Cbl-bshRNA的胃癌MG

6、C803細胞與轉(zhuǎn)染vector的細胞相比較，對5-FU的敏感性是否存在差異;明確Cbl-b是否可以通過EGFR/SRC/AKT信號通路調(diào)控5-FU抑制胃癌細胞增殖。
　　材料和方法
　　1、細胞培養(yǎng)
　　2、Cbl-bshRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌MGC803細胞系的建立
　　3、MTT檢測增殖抑制
　　4、流式細胞儀檢測細胞凋亡
　　5、免疫沉淀及免疫雜交檢測蛋白表達
　　6、統(tǒng)計學處理:每次實驗重復

7、3次，數(shù)據(jù)以Mean±S.D.表示，采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果
　　一、5-FU對胃癌細胞增殖抑制和凋亡的影響
　?。ㄒ唬?-FU作用胃癌MGC803細胞不同時間（24h、48h和72h）可抑制細胞增殖，不同劑量5-FU作用三種胃癌細胞系（MGC803、SGC7901和BGC823）48h可不同程度抑制細胞增殖，IC50值分別是2.0±0.9μg/mL、4.5±1.1μg/

8、mL和1.3±0.8μg/mL，差異無統(tǒng)計學意義，P值均＞0.05。
　?。ǘ?-FU（2.0μg/mL）作用不同時間(24h，48h和72h)可誘導MGC803細胞不同程度的凋亡，5-FU(2.0μg/mL)作用三種胃癌細胞系(MGC803、SGC7901和BGC823)48h可引起不同程度的細胞凋亡。
　?。ㄈ?-FU（2.0μg/mL）作用MGC803細胞6h可見TS三元復合物表達增多，48h表達最強，提示5-FU

9、通過與TS形成穩(wěn)定三元復合物抑制游離TS酶活性，抑制胃癌細胞增殖。
　?。ㄋ模┎煌瑵舛?2.0μg/mL，20.0μg/mL)5-FU作用MGC803細胞48h可誘導線粒體膜電位不同程度下降，提示5-FU通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位誘導MGC803細胞凋亡。
　?。ㄎ澹?-FU（2.0μg/mL）作用MGC803細胞48h可明顯抑制Bcl-2蛋白表達，對BAX蛋白表達無顯著影響，Bcl-2/BAX比值明顯下調(diào)，提示5-FU可通過調(diào)節(jié)

10、Bcl-2/BAX比值誘導MGC803細胞凋亡。
　　二、5-FU作用MGC803細胞增殖信號通路蛋白的表達
　　（一）5-FU(2.0μg/mL)作用MGC8031h可見磷酸化EGFR表達增強，在5-FU作用6h達峰值，在5-FU作用24h磷酸化EGFR表達逐漸下降。
　?。ǘ?-FU(2.0μg/mL)作用MGC8031h可見磷酸化SRC表達增強，在5-FU作用6h達峰值，在5-FU作用24h磷酸化SRC表達逐漸

11、下降。
　　（三）5-FU（2.0μg/mL）作用MGC8031h可見磷酸化AKT表達增強，在5-FU作用6h達峰值，在5-FU作用24h磷酸化AKT表達下降。
　　（四）5-FU(2.0μg/mL)作用MGC8031h可見磷酸化ERK表達下降，在5-FU作用24h表達增強，在5-FU作用48h表達最強。
　?。ㄎ澹㎝EK/ERK通路抑制劑PD98059(20μM)作用MGC803細胞24h及48h，可明顯抑制5-FU

12、誘導的ERK活化。
　?。㏄D98059(20μM)及LY294002(25μM)可明顯增加5-FU誘導MGC803細胞凋亡(25.42±4.0％，40.63±3.5％)（p值分別為0.011和0.001）。
　　三、Cbl調(diào)節(jié)5-FU活性機制的研究
　?。ㄒ唬┟庖叱恋砑懊庖哂∮浗Y(jié)果顯示，5-FU（2.0μg/mL）作用MGC803細胞24hCbl-b活化增強，持續(xù)至48h，提示Cbl-b可能參與調(diào)節(jié)5-FU抑制胃

13、癌細胞增殖。
　?。ǘ┙bl-bshRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌MGC803細胞，westernblot結(jié)果顯示，與Vector組比較，Cbl-bshRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌MGC803細胞無Cbl-b蛋白表達。MTT檢測結(jié)果顯示，與Vector組比較，Cbl-bshRNA組細胞增殖活性增強，48h的IC50值分別為10.67±5.0μg/mL和1.57±0.7μg/mL(p=0.001)。
　　（三）流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，5-FU

14、(2.0μg/mL)作用48hCbl-bshRNA組與Vector組的凋亡百分率分別為18±3.0和32±4.0(p=0.001)。提示Cbl-bshRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌MGC803細胞對5-FU的敏感性下降。
　?。ㄋ模?-FU(2.0μg/mL)作用48h，Cbl-bshRNA組與Vector組的跨膜電位下降百分率分別為18±4.3和30±6.2，p=0.001;5-FU作用72h，Cbl-bshRNA組與Vector組的跨膜電

15、位下降率分別為和37±5.6和63±7.4，p=0.001。結(jié)果提示Cbl-b通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位下降誘導胃癌細胞凋亡。
　?。ㄎ澹￤esternblot結(jié)果顯示，5-FU(2.0μg/mL)作用48h，與Vector組比較，Cbl-bshRNA組Bcl-2表達上調(diào)，Bcl-2/BAX比值上調(diào)，提示Cbl-bshRNA組通過上調(diào)Bcl-2/BAX比值減少胃癌細胞凋亡，即Cbl-b通過下調(diào)Bcl-2/BAX比值誘導胃癌細胞凋亡。

16、r>　?。￤esternblot結(jié)果顯示，在5-FU(2.0μg/mL)作用下，與vector組比較，Cbl-bshRNA組EGFR、SRC及AKT的活化時間延長，對ERK的活化無明顯影響，對TS的表達也無明顯影響。提示Cbl-bshRNA組可能通過活化EGFR/SRC/AKT通路減少胃癌細胞凋亡，也就是說，Cbl-b可能通過下調(diào)EGFR/SRC/AKT通路的活化增加胃癌細胞對5-FU的敏感性。
　?。ㄆ撸￤esternblo

17、t結(jié)果顯示，與vector組比較，5-FU(2.0μg/mL)作用Cbl-bshRNA組TS蛋白表達無明顯差異，提示Cbl-b可能不是通過調(diào)節(jié)TS蛋白表達影響胃癌細胞對5-FU的敏感性。
　　結(jié)論
　　1、5-FU以時間劑量依賴的方式抑制胃癌細胞增殖，誘導胃癌細胞凋亡。
　　2、EGFR/SRC/AKT信號通路參與5-FU抑制胃癌細胞增殖。
　　3、Cbl-b通過調(diào)節(jié)EGFR/SRC/AKT信號通路參與調(diào)控5-F