特異性啟動(dòng)子控制雙自殺基因系統(tǒng)靶向治療多藥耐藥膠質(zhì)瘤的研究.pdf

1、第一部分 腦膠質(zhì)瘤多藥耐藥細(xì)胞系C6/ADR的建立及鑒定 目的： 采用逐漸增加培養(yǎng)基中藥物濃度的方法聯(lián)合短期暴露于高濃度的抗癌藥物的方法，在體外建立腦膠質(zhì)瘤C6耐阿霉素細(xì)胞株MDR細(xì)胞系，觀察C6及C6/ADR細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，并對(duì)其多藥耐藥特性進(jìn)行鑒定，為下一步的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。 研究方法： （1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C6細(xì)胞在37℃，5％CO2全濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)于低濃度的阿霉素，每種藥物濃度維持四周后，然后暴露

2、在高藥物濃度中進(jìn)行培養(yǎng)36小時(shí)，利用MTT法，計(jì)算不同藥物對(duì)C6細(xì)胞的抑制率，來確定阿霉素藥物終濃度為1μg/ml。 （2）用光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡觀察活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及生長(zhǎng)特點(diǎn)或經(jīng)HE染色后觀察。 （3）利用MTT法，以540nm為測(cè)試波長(zhǎng)，630nm為參考波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀上讀取C6及C6/ADR細(xì)胞的光密度值，以O(shè)D值代表細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線，來觀察細(xì)胞增殖情況，并計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間。并利用克隆形成

3、試驗(yàn)測(cè)定C6及C6/ADR單個(gè)細(xì)胞增殖能力，將培養(yǎng)板倒置并疊加一張帶網(wǎng)絡(luò)的透明膠片，在顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，來計(jì)算克隆形成率。 （4）RT-PCR法來檢測(cè)C6及C6/ADR細(xì)胞MDR1基因mRNA水平變化：用UNIQ-10柱離心式Trizol總RNA抽提試劑盒提取細(xì)胞總RNA，利用非特異性引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后用MDR1檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠中電泳30 min，紫外透射分析儀下觀

4、察結(jié)果并拍照。同時(shí)，用Western blot法分析C6及C6/ADR細(xì)胞中MDR1蛋白的表達(dá)情況。利用流式細(xì)胞免疫學(xué)方法對(duì)多藥耐藥基因MDR1編碼蛋白P-gp的進(jìn)行定量研究。 （5）收集并整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論： （1）C6及C6/ADR細(xì)胞在光鏡下兩者差別不大，但透射電鏡發(fā)現(xiàn)C6/ADR細(xì)胞和C6細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)明顯不同，特別是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體豐富，這提示隨著耐藥性的增加，

5、酶類的合成也在增加，進(jìn)一步提示了耐藥的復(fù)雜性。 （2）C6/ADR細(xì)胞產(chǎn)生耐藥后，其細(xì)胞倍增時(shí)間以及單個(gè)細(xì)胞的克隆能力與C6細(xì)胞沒有太大差異，這說明C6/ADR細(xì)胞的增殖能力以及單個(gè)細(xì)胞的克隆能力并沒有受到明顯的影響。 （3）多藥耐藥蛋白基因能夠在C6/ADR細(xì)胞中能夠高表達(dá)P-gp，而在C6細(xì)胞中基本不表達(dá)。 第二部分 MDR1啟動(dòng)子控制雙自殺基因系統(tǒng)的建立及其在耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)的研究 目的：

6、 從耐藥膠質(zhì)瘤C6/ADR細(xì)胞中克隆多藥耐藥基因啟動(dòng)子，構(gòu)建MDR1P控制的雙自殺基因表達(dá)載體，并初步研究其在C6/ADR中的表達(dá)情況。 研究方法： （1）提取C6/ADR基因組DNA，PCR擴(kuò)增MDR1P，克隆入T載體，NdeⅠ和HindⅢ雙酶切MDR1P，獲得相應(yīng)粘性末端的MDR1P片段，純化并進(jìn)行加A反應(yīng)，將其連接入通用載體pMD18Simple-T中，形成MDR1P-T載體，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)菌后小量提

7、取質(zhì)粒，PCR及測(cè)序鑒定。 （2）NdeⅠ/HindⅢ雙酶切pcDNA3-TK質(zhì)粒和MDR1P-T載體，利用T4 DNA連接酶用MDR1P置換pcDNA3-TK中的CMV啟動(dòng)子，獲得pcDNA3-MDR1P-TK，進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定。 （3）利用BamHⅠ酶切pcDNA3-MDR1P-TK及pcDNA3-CD-TK，將pcDNA3-CD-TK中的CD基因插入到pcDNA3-MDR1P-TK中TK基因的上游，從而獲得pc

8、DNA3-MDR1P-CD-TK，進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定。 （4）在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將pcDNA3-MDR1P-CD-TK轉(zhuǎn)染C6和C6/ADR細(xì)胞，G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，用PCR鑒定自殺基因在兩種細(xì)胞中的整合情況，RT-PCR鑒定CD、TK在在兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)情況。 結(jié)果： （1）從C6/ADR基因組DNA中提取的MDR1P片段，PCR成功擴(kuò)增出260bp的MDR1P并克隆入T載體后，PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

9、，與基因bank的序列一致。 （2）經(jīng)分子克隆技術(shù)將MDR1P成功插入pcDNA3-TK質(zhì)粒中，形成pcDNA3-MDR1P-TK，PCR擴(kuò)增可見1600bp大小的陽性條帶。 （3）經(jīng)過BamHⅠ酶切質(zhì)粒pcDNA3-CD-TK后獲得CD基因，通過基因重組技術(shù)成功將其插入同樣酶切后的pcDNA3-MDR1P-TK質(zhì)粒TK基因的上游，形成pcDNA3-MDR1P-CD-TK；PCR結(jié)果顯示1～4均為陽性克隆，初步表明重組正

10、確。 （4）脂質(zhì)體法將質(zhì)粒pcDNA3-MDR1P-CD-TK成功穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入C6和C6/ADR細(xì)胞，命名為C6/CDTK、C6/ADR/CDTK，其形態(tài)與C6、C6/ADR細(xì)胞無差異。 結(jié)論： （1）成功建立了MDR1啟動(dòng)子調(diào)控的CD-TK雙自殺融合基因表達(dá)系統(tǒng)。 （2）將質(zhì)粒pcDNA3-MDR1P-CD-TK成功穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入C6和C6/ADR細(xì)胞，獲得穩(wěn)定的C6/CDTK、C6/ADR/CDTK轉(zhuǎn)染細(xì)胞

11、。 （3）證實(shí)MDR1啟動(dòng)子調(diào)控的CD-TK雙自殺融合基因表達(dá)系統(tǒng)能夠在耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞可特異性表達(dá)，而在C6/CDTK細(xì)胞中不表達(dá)。 第三部分 MDR1啟動(dòng)子靶向的雙自殺基因/前體藥物治療多藥耐藥膠質(zhì)瘤的研究 目的： 研究多藥耐藥基因啟動(dòng)子靶向控制的CD-TK雙自殺基因系統(tǒng)并加前體藥物丙氧鳥苷及5-氟胞嘧啶（pcDNA3-MDR1P-CD-TK/GCV+5-FC）對(duì)MDR1高表達(dá)的耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外特異

12、性殺傷作用。 研究方法： （1）將雙自殺基因轉(zhuǎn)染的C6細(xì)胞、C6/ADR細(xì)胞各分兩組，分別接種于6孔培養(yǎng)板中，加入含或不含GCV60μg/ml、5-FC600μg/ml的RPMI-1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀況。 （2）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6、C6/ADR、C6/CDTK、C6/ADR/CDTK細(xì)胞，加入不同濃度的前體藥物GCV和/或5-FC，對(duì)照組不加前體藥物，利用MTT法，以

13、540nm為測(cè)試波長(zhǎng)，630nm為參考波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀上讀取用C6及C6/ADR細(xì)胞的光密度值，以細(xì)胞生存率為縱坐標(biāo)，以前體藥物濃度為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞存活曲線，來觀察細(xì)胞存活情況。 （3）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6、C6/ADR、C6/CDTK、C6/ADR/CDTK細(xì)胞，加入含或不含GCV60μg/ml、5-FC600μg/ml的RPMI-1640培養(yǎng)液，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡，利用TUNNEL，法用顯微鏡來觀察細(xì)胞的死亡情

14、況。 （4）取3×104/ml的C6、C6/ADR、C6/CDTK、C6/ADR/CDTK細(xì)胞，加入含或不含GCV60μg/ml、5-FC600μg/ml的RPMI-1640培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板倒置并疊加一張帶網(wǎng)絡(luò)的透明膠片，在顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，來計(jì)算克隆形成率。 （5）收集并整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果： （1）未轉(zhuǎn)染自殺基因的C6、C6/ADR細(xì)胞，應(yīng)用

15、前體藥物后，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞增殖無明顯變化；且GCV和5-FC聯(lián)合用藥較二者單獨(dú)用藥也無明顯差異；而C6/ADR/CDTK細(xì)胞用藥后內(nèi)顆粒逐漸增多，細(xì)胞變得越來越皺縮，貼壁性能減弱，生長(zhǎng)狀態(tài)變差，細(xì)胞數(shù)量變少，且聯(lián)合用藥更加明顯。 （2）MTT結(jié)果顯示C6/CDTK細(xì)胞的存活率比C6細(xì)胞下降稍明顯一些，隨著藥物濃度的增大細(xì)胞存活率有輕微的下降情況，C6/ADR細(xì)胞存活率與C6細(xì)胞相似，細(xì)胞存活率變化不大，而C6/AD

16、R/CDTK細(xì)胞增殖明顯受抑，細(xì)胞存活率明顯下降，且有明顯的劑量依賴關(guān)系。 （3）流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示加入前體藥物后與C6/CDTK細(xì)胞相比，C6/ADR/CDTK細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率明顯提高，而且聯(lián)合用藥比單一用藥效果更顯著，凋亡率達(dá)到22.64％；另外，C6/ADR/CDTK細(xì)胞的細(xì)胞周期絕大部分被阻滯在G1期，且?guī)谉oDNA合成。利用TUNNEL法來檢測(cè)C6細(xì)胞、C6/ADR細(xì)胞、C6/CDTK細(xì)胞結(jié)果為陰性，C6/ADR/C