Shh蛋白在小鼠肢芽上的表達(dá)研究.pdf

1、目的：先天性多指(趾)(PPD)是一種常見(jiàn)的肢體畸形病征，臨床表現(xiàn)主要為超出正常數(shù)目的手指(腳趾)贅生，在新生兒中的發(fā)生率居于各類(lèi)肢體畸形之首。多指畸形除了獨(dú)立發(fā)生外，還可以作為一些綜合征的部分癥狀而伴隨出現(xiàn)。軸前多指(趾)為發(fā)生在肢體橈(脛)側(cè)的多余指(趾)，按照受累指(趾)發(fā)生部位，可劃分為4個(gè)亞型(I-IV)，分別代表二指節(jié)拇指多指、三指節(jié)拇指多指、食指多指與多指并指。軸前多指(趾)家系大多為常染色體顯性遺傳(AD)，從簡(jiǎn)單的三指

2、節(jié)拇指單個(gè)指骨增加直至完整的額外指(趾)的產(chǎn)生，患病個(gè)體表型有明顯差異。指(趾)的發(fā)育過(guò)程是一個(gè)圖式發(fā)育過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中，Shh( SoIuc hedgehog)作為ZPA區(qū)的形態(tài)發(fā)生蛋白起著重要的作用。有報(bào)道表明Shh通過(guò)擴(kuò)散影響第二指(趾)的發(fā)生，而三到五指(趾)的發(fā)育不需要通過(guò)蛋白的擴(kuò)散，第一指(趾)的發(fā)生不需要Shh的參與。Shh異位表達(dá)在肢芽前部就會(huì)出現(xiàn)多指現(xiàn)象，表現(xiàn)為先天性多指(趾)。通過(guò)對(duì)軸前多指家系血清進(jìn)行連鎖分析和單

3、倍型構(gòu)建，將該家系的致病位點(diǎn)定位在染色體7q36上的1.7cM范圍內(nèi)，并且通過(guò)遺傳分析排除了shh基因自身序列改變致病的可能。ZPA調(diào)控序列(ZRS)位于染色體7q36的LMBR1內(nèi)含子5上，其基因位點(diǎn)發(fā)生突變后，影響Shh在肢芽上的表達(dá)。正常情況下，Shh只表達(dá)在肢芽后部，PPD突變的個(gè)體中Shh在肢芽前后部都有表達(dá)。本項(xiàng)目以小鼠為研究對(duì)象，研究胚胎發(fā)育時(shí)Shh在正常肢芽上的表達(dá)狀況。以此為基礎(chǔ)，將突變后的ZRS基因?qū)胄∈笈咛ジ杉?xì)胞

4、中，研究突變后的小鼠Shh表達(dá)狀況和突變后的小鼠肢芽生長(zhǎng)情況。
　　 方法：將適齡的ICR小鼠進(jìn)行交配，次日檢查，將產(chǎn)生陰栓的母鼠標(biāo)記為E0.5天，E8.0天開(kāi)始進(jìn)行解剖取胚，E8.0-E12.5天進(jìn)行整胚免疫組化染色，E12.5-E16.5天進(jìn)行切片免疫組化染色，染色后的切片在顯微鏡下進(jìn)行拍片。對(duì)Shh質(zhì)粒擴(kuò)增后抽提，進(jìn)行酶切鑒定和電泳鑒定。
　　 結(jié)果：E8-E12.5天的小鼠全胚免疫組化棕黑色的部分表示的是陽(yáng)性，

5、黑色部分越大，陽(yáng)性率越高。結(jié)果E10天時(shí)Shh開(kāi)始有表達(dá)，E10.5天時(shí)表達(dá)量逐漸增多，E11天時(shí)在肢芽后部大量表達(dá)，E12天時(shí)表達(dá)量減少，E12.5天時(shí)已檢測(cè)不出Shh的表達(dá)。E12.5-E16.5天的胚胎為切片免疫組化，Shh在E12.5-E16.5天時(shí)免疫組化染色結(jié)果都是陰性。電泳鑒定結(jié)果獲得了清晰的Shh質(zhì)粒酶切片段電泳圖。
　　 結(jié)論：本研究運(yùn)用整胚免疫組化和切片免疫組化相結(jié)合的方法，得到了Shh在各個(gè)時(shí)期的胚胎肢芽上