微顆粒在脂氧素合成和腫瘤治療中的作用.pdf

1、[目的]在炎癥發(fā)生時,花生四烯酸經(jīng)過脂加氧酶的催化下產(chǎn)生促炎癥消退的脂類介質(zhì)脂氧素A4。經(jīng)過多年的研究發(fā)現(xiàn)脂氧素在炎癥的消退的過程中發(fā)揮著重要的作用,然而脂氧素的產(chǎn)生機制仍然沒有被完全闡明。本研究通過對血小板來源微顆粒的檢測,從細胞和動物模型分別進行了研究,從新的角度闡明了體內(nèi)和體外脂氧素合成的又一新的途徑和機制。
　　[方法]
　　1.血小板來源微顆粒的分離與制備
　　人或者鼠的外周血抗凝后提取血清中的血小板,經(jīng)10

2、μMADP刺激后,利用高速離心的方法14000g×1h后提取血小板釋放的微顆粒。
　　2.血小板微顆粒中12-LO的檢測
　　將血小板來源的微顆粒提取后,用NP-40裂解液提取其總蛋白,然后采用免疫印跡的方法檢測其12-LO的表達。
　　3.經(jīng)血小板來源微顆粒治療后,LPS誘導的炎癥模型中的相關因子的檢測
　　18-20gBalb/c小鼠腹腔注射2μgLPS1h后,再腹腔注射血小板來源的微顆粒。5h后,取腹腔灌洗

3、細胞和灌洗液檢測相關炎癥因子IFN-γ,IL-6,IL-10,CCL2和iNOS的表達。
　　4.經(jīng)血小板來源微顆粒治療后,DSS誘導的結腸炎模型中的相關因子的檢測
　　18-20gBalb/c小鼠飲用含3.5％DSS的飲用水,同時每只小鼠每天腹腔注射1×106血小板來源的微顆粒,每天記錄體重。5-7天后,處死小鼠,觀察結腸的變化并檢測相關炎性因子IL-18,IFN-γ和TNF-α的表達。
　　[結果]
　　1.

4、血小板來源的微顆粒中包含著12-LO
　　人或者鼠的外周血抗凝后提取血清中的血小板,經(jīng)10μMADP刺激后,利用高速離心的方法14000g×1h后提取血小板釋放的微顆粒。將血小板來源的微顆粒提取后,用NP-40裂解液提取其總蛋白,然后采用免疫印跡的方法檢測其12-LO的表達。結果顯示對照組和經(jīng)ADP刺激的血小板來源的微顆粒中都有12-LO的表達。
　　2.在體外肥大細胞攝取血小板來源的微顆粒后可以產(chǎn)生LXA4
　　將骨

5、髓來源誘導的肥大細胞與血小板來源的微顆粒進行共孵育,12h后用ELISA的方法檢測培養(yǎng)上清中LXA4的表達。結果顯示,僅在二者共孵育的上清中可以檢測到LXA4的表達,而在單獨的肥大細胞和單獨的微顆粒培養(yǎng)上清中則沒有LXA4的表達。
　　3.在體內(nèi)腹腔肥大細胞可以攝取血小板來源的微顆粒并產(chǎn)生LXA4
　　將血小板來源的微顆粒用紅色膜染料PKH26染成紅色后腹腔注射到Balb/c腹腔中,6h后取腹腔細胞進行流式細胞染色,并取腹腔

6、灌洗液檢測LXA4的水平。結果顯示大部分c-kit陽性的細胞(80.4%)都顯示PKH26陽性,并且在腹腔灌洗液檢測到了LXA4的表達。
　　4.體內(nèi)腹腔肥大細胞吞噬血小板來源的微顆粒產(chǎn)生的LXA4可以抑制LPS誘導的炎癥
　　18-20gBalb/c小鼠腹腔注射2μgLPS1h后,再腹腔注射血小板來源的微顆粒。5h后,取腹腔灌洗細胞和灌洗液檢測相關炎癥因子IFN-γ,IL-6,IL-10,CCL2和iNOS的表達。結果發(fā)現(xiàn)

7、,血小板來源的微顆粒注射組和LXA4注射組中IFN-γ表達均下降,而IL-10的表達則明顯增加。
　　5.體內(nèi)腹腔肥大細胞吞噬血小板來源的微顆粒產(chǎn)生的LXA4可以抑制DSS誘導的結腸炎
　　18-20gBalb/c小鼠飲用含3.5%DSS的飲用水,同時每只小鼠每天腹腔注射1×106血小板來源的微顆粒,每天記錄體重。5-7天后,處死小鼠,觀察結腸的變化并檢測相關炎性因子IL-18,IFN-γ和TNF-α的表達。結果發(fā)現(xiàn),血小板