脂聯(lián)素及其受體在COPD疾病進(jìn)展中的作用.pdf

1、慢性阻塞性肺疾?。–hronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是一種常見(jiàn)的慢性氣道炎癥性疾病，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。脂聯(lián)素（Adiponectin）是由脂肪細(xì)胞分泌一種重要的脂肪因子，在外周血循環(huán)中可見(jiàn)脂聯(lián)素的全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)[又分為三聚體、六聚體和高等分子量體構(gòu)型（HMW）]以及球型結(jié)構(gòu)域（global adiponectin,gAd），卻未發(fā)現(xiàn)過(guò)單體，它能夠與其特異性的受體AdipoR1、AdipoR

2、2和T-cadherin結(jié)合，發(fā)揮抗粥樣硬化、抗凋亡、抗炎、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移等積極的保護(hù)作用。
　　關(guān)于脂聯(lián)素在COPD中的生物學(xué)作用目前仍存有爭(zhēng)議。動(dòng)物研究顯示脂聯(lián)素具有保護(hù)性作用，低脂聯(lián)素血癥會(huì)促進(jìn)COPD的進(jìn)展，并且脂聯(lián)素敲除小鼠形成的COPD容易并發(fā)肥胖及心血管疾病。而臨床研究發(fā)現(xiàn)COPD患者脂聯(lián)素水平增高，以高等分子量體（HMW）脂聯(lián)素水平增高為主，并且與肺功能的損害程度及TNF-α水平呈正

3、相關(guān)。那么，是否不同構(gòu)型的脂聯(lián)素在COPD疾病進(jìn)展中發(fā)揮不同的作用或者COPD患者可能存在脂聯(lián)素受體的表達(dá)水平下調(diào)及其生物學(xué)功能的變化，從而影響脂聯(lián)素保護(hù)性作用的發(fā)揮，還需要進(jìn)一步的科學(xué)研究來(lái)證實(shí)。
　　有研究提示脂聯(lián)素受體2（AdipoR2）的表達(dá)受miR-150的調(diào)控，從而影響脂聯(lián)素生物學(xué)作用的發(fā)揮。miR-150對(duì)AdipoR2表達(dá)的影響在COPD疾病發(fā)生發(fā)展中的作用還需要進(jìn)一步的科學(xué)研究來(lái)證實(shí)。
　　基于以上研究現(xiàn)狀

4、與背景，本研究將通過(guò)觀察：
　?。?）不同構(gòu)型脂聯(lián)素對(duì)煙草煙霧提取物誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞凋亡及損傷的影響；
　?。?）HMW脂聯(lián)素及其受體在COPD患者肺組織及血清中表達(dá)水平的變化；
　?。?）miR-150在COPD患者肺組織中的表達(dá)水平及其與脂聯(lián)素受體2相關(guān)性，探討脂聯(lián)素及其受體在COPD疾病進(jìn)展中的作用，為COPD及其合并癥的預(yù)防和早期診斷提供新的思路。
　　目的：
　　1.研究高等分子量體(HMW

5、)脂聯(lián)素和球形結(jié)構(gòu)域(gAd)脂聯(lián)素對(duì)煙草煙霧提取物誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞（16HBECs）凋亡水平、炎癥因子及氧化物質(zhì)表達(dá)的影響。
　　2.研究COPD患者肺組織及血清中HMW脂聯(lián)素及其受體的表達(dá)水平變化。
　　3.研究miR-150在COPD患者肺組織中的表達(dá)水平變化及其與脂聯(lián)素受體2的相關(guān)性。
　　方法：
　　1.16HBECs常規(guī)培養(yǎng)后接種于6孔培養(yǎng)板中，隨機(jī)分為對(duì)照組、5％CSE組、HMW脂聯(lián)素干預(yù)組和

6、gAd脂聯(lián)素干預(yù)組。對(duì)照組加入培養(yǎng)液；5%CSE組加入5%濃度CSE孵育24h；HMW、gAd干預(yù)組分別先以不同濃度的HMW脂聯(lián)素或gAd脂聯(lián)素預(yù)處理細(xì)胞2h，再加入5％CSE培養(yǎng)24h，收集各組別的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、4-HNE水平，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平及細(xì)胞內(nèi)ROS水平。
　　2.選取2013年~2015年山西大醫(yī)院胸外科因肺部病變行肺葉切除術(shù)且術(shù)后病理學(xué)診斷明確的41例患者

7、，男26例，女15例，年齡(61±9)歲。分為肺功能正常組23例，其中病理結(jié)果為良性病變患者13例，病理結(jié)果為非小細(xì)胞肺癌患者10例；COPD組18例，其中病理診斷良性病變者10例，為單純COPD組，病理診斷非小細(xì)胞肺癌患者8例，為COPD合并肺癌組。COPD組患者嚴(yán)格按照COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)明確診斷，均為穩(wěn)定期患者。手術(shù)前2周內(nèi)均無(wú)全身或呼吸道感染癥狀，血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血沉及肝腎功能等均正常。
　　排除標(biāo)準(zhǔn)：
　　(1)合并肺結(jié)

8、核、肺炎、間質(zhì)性肺疾病、支氣管哮喘及支氣管擴(kuò)張等其他肺部疾病，有高血壓、糖尿病、冠心病等其他系統(tǒng)疾病及感染性疾病。
　　(2)各種原因所致的阻塞性肺炎。
　　(3)慢阻肺患者處于急性加重期。
　　(4)術(shù)前已放療或化療。
　　(5)不愿意配合和完全不能交流的患者。
　　此項(xiàng)研究已經(jīng)過(guò)學(xué)校倫理委員會(huì)審核通過(guò)。所有研究對(duì)象均已簽字同意。
　　3.手術(shù)方案由胸外科醫(yī)生制定并實(shí)施，術(shù)前記錄患者呼吸系統(tǒng)癥狀、藥

9、物治療史、吸煙史(吸煙指數(shù)＝每日吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù))、CAT評(píng)分等臨床資料，記錄術(shù)前1周肺功能、血?dú)夥治龅葯z查結(jié)果。術(shù)前經(jīng)過(guò)整晚禁食后，于早晨采取外周靜脈血10ml，分離血清儲(chǔ)存于-80℃冰箱中備用。術(shù)中遠(yuǎn)離肺部病灶>5 cm取肺組織，肉眼觀察無(wú)肺癌浸潤(rùn)的外周新鮮肺組織(2.5 cm×2.0 cm×2.0 cm)，PBS液沖洗血跡后儲(chǔ)存于-80℃冰箱中備用。
　　4.采用 ELISA法檢測(cè)肺組織勻漿和血清中 HMW脂聯(lián)素、T-鈣黏

10、蛋白（T-cadherin）、IL-6、IL-10、TNF-α、CRP、4-HNE和SP-D的表達(dá)水平。
　　5.采用Western blot法檢測(cè)肺組織脂聯(lián)素受體1(AdipoR1）、脂聯(lián)素受體2（AdipoR2）和T-鈣黏蛋白（T-cadherin）的蛋白表達(dá)水平。
　　6.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-150的靶基因。
　　7.采用熒光定量PCR法檢測(cè)肺組織miR-150的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.3個(gè)

11、不同濃度HMW脂聯(lián)素干預(yù)組IL-6、4-HNE蛋白含量、細(xì)胞內(nèi)ROS水平及細(xì)胞早凋率均低于5％CSE組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01）。
　　2.3個(gè)不同濃度gAd脂聯(lián)素干預(yù)組IL-6、4-HNE蛋白含量、細(xì)胞內(nèi)ROS水平及細(xì)胞早凋率也均低于5％CSE組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01）。
　　3.HMW脂聯(lián)素和gAd脂聯(lián)素與IL-6、4-HNE蛋白含量、細(xì)胞內(nèi)ROS水平及細(xì)胞早凋率呈負(fù)相關(guān)（P均<0.01）。

12、r>　　4.COPD組HMW脂聯(lián)素和細(xì)胞因子的表達(dá)水平
　　與肺功能正常組相比，COPD組肺組織和血清中HMW脂聯(lián)素表達(dá)水平均增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）。
　　與肺功能正常組相比，COPD組肺組織和血清中IL-6、IL-10、CRP、4-HNE、TNF-α和SP-D均表達(dá)增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）。
　　5.COPD組脂聯(lián)素受體的表達(dá)水平
　　與肺功能正常組相比，COPD組肺組織中

13、AdipoR1表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；AdipoR2表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　與肺功能正常組相比，COPD組肺組織和血清中T-cadherin表達(dá)未見(jiàn)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　6. COPD組HMW脂聯(lián)素與細(xì)胞因子及脂聯(lián)素受體2之間的相關(guān)性分析
　　COPD組血清中HMW脂聯(lián)素的表達(dá)與IL-6、IL-10、CRP、TNF-α、4-HNE和SP-

14、D均呈正相關(guān)（P均<0.05）。
　　COPD組肺組織HMW脂聯(lián)素與脂聯(lián)素受體2的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。
　　7.COPD組血清中HMW脂聯(lián)素與患者臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性分析
　　COPD組血清中HMW脂聯(lián)素與肺功能FEV1占預(yù)計(jì)值的百分比、動(dòng)脈血氧分壓呈負(fù)相關(guān)，與CAT評(píng)分呈正相關(guān)（P均<0.05）。
　　8.COPD合并肺癌組HMW脂聯(lián)素、細(xì)胞因子和脂聯(lián)素受體的表達(dá)
　　在COPD組內(nèi)，與單純

15、COPD組相比，COPD合并肺癌組肺組織和血清中HMW脂聯(lián)素和IL-6、IL-10、CRP、TNF-α、4-HNE和SP-D的表達(dá)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01）。
　　在COPD組內(nèi)，與單純COPD組相比，COPD合并肺癌組肺組織中脂聯(lián)素受體1和T-cadherin的表達(dá)均明顯升高，脂聯(lián)素受體2表達(dá)明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　9.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果
　　利用多個(gè)生物信息學(xué)靶基因

16、預(yù)測(cè)網(wǎng)站分析并預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn) miR-150種子序列與AdipoR2的3’UTR序列452-459堿基可完全配對(duì)，存在結(jié)合位點(diǎn)，并且預(yù)測(cè)分值>90。
　　10.兩組肺組織miR-150表達(dá)水平
　　雙因素方差分析提示肺癌、COPD兩因素對(duì)miR-150的表達(dá)存在明顯的交互作用(F=59.61，P<0.01)。進(jìn)一步行簡(jiǎn)單效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，與肺功能正常的非肺癌患者相比，單純COPD患者 miR-150表達(dá)未見(jiàn)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

17、（P>0.05）；與肺功能正常的非小細(xì)胞肺癌患者相比，COPD合并非小細(xì)胞肺癌患者miR-150表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　11.COPD組肺組織miR-150表達(dá)水平及其與AdipoR2表達(dá)之間的相關(guān)性
　　在COPD組內(nèi)，與單純COPD組相比，COPD合并肺癌組肺組織miR-150表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　在COPD組內(nèi)，單純COPD組肺組織miR-150與

18、AdipoR2的表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性（P>0.05）；COPD合并肺癌組中，肺組織miR-150與AdipoR2的表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.HMW脂聯(lián)素及gAd脂聯(lián)素可以降低煙草煙霧提取物對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞的凋亡及損傷作用，其可能成為COPD新的治療靶點(diǎn)。
　　2.HMW脂聯(lián)素和多種細(xì)胞因子共同參與了COPD的病理生理過(guò)程，并且與患者的肺功能、低氧血癥和臨床癥狀評(píng)分密切相關(guān)。
　　3

19、.作為HMW脂聯(lián)素的受體，AdipoR2的表達(dá)下調(diào)影響了其保護(hù)性的抗炎作用，從而可能促進(jìn)了在COPD的疾病進(jìn)展
　　4.作為HMW脂聯(lián)素特異性的受體，T-cadherin可能并未參與COPD的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激機(jī)制中。T-cadherin的表達(dá)上調(diào)可能參與了COPD合并非小細(xì)胞肺癌的病理生理過(guò)程。
　　5.脂聯(lián)素受體表達(dá)的變化可能成為COPD合并非小細(xì)胞肺癌的生物學(xué)預(yù)測(cè)指標(biāo)。
　　6.miR-150在COPD患者中表達(dá)