西瓜噬酸菌Aac-5菌株AAA ATPases基因moxR和ruvB功能研究.pdf

1、瓜類細(xì)菌性果斑?。˙actrrial fruit blotch, BFB）是由西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）引起的種傳檢疫性病害，西瓜噬酸菌為革蘭氏陰性菌，在植株整個(gè)生長期內(nèi)均可發(fā)生侵染，能夠造成果實(shí)腐爛，在全國范圍發(fā)病呈上升趨勢，發(fā)病時(shí)導(dǎo)致西甜瓜大面積減產(chǎn)甚至絕收，嚴(yán)重威脅西甜瓜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。
　　AAA ATPases（ATPases associated with diverse cellular ac

2、tivities）是一種與多種細(xì)胞活性相關(guān)的酶，能夠通過利用分解產(chǎn)生的ATP廣泛參與膜融合、蛋白質(zhì)水解、DNA復(fù)制等多種細(xì)胞活動(dòng)。該家族蛋白具有200~250個(gè)高度保守的氨基酸殘基，被稱為“AAA盒”，六聚體是其活性結(jié)構(gòu)，活性位點(diǎn)處于六聚體孔穴中央。AAA ATPases超家族在細(xì)菌中由ClpXP，F(xiàn)tsH，Lon，MoxR，RuvB， HrcN等亞家族組成。
　　本研究通過同源重組雙交換的方法構(gòu)建西瓜噬酸菌moxR基因以及ruv

3、B基因全缺失突變菌株及互補(bǔ)菌株，測定了突變菌株及互補(bǔ)菌株的致病性、煙草過敏性、運(yùn)動(dòng)性、生長能力、生物膜形成等；并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測定了AAA ATPases與Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因（hrcN和hrpE）、毒性蛋白相關(guān)基因（trbC和virB）、鞭毛相關(guān)基因（fliR和fliM）、菌毛相關(guān)基因（pinC-1和pinC-2）以及AAA ATPases亞家族RuvB相關(guān)基因（ruvA和ruvC）的關(guān)系。結(jié)果表明，moxR基因以及ruv

4、B基因全缺失突變菌株的致病力降低、運(yùn)動(dòng)性減弱、生長能力下降、生物膜形成能力增強(qiáng)，煙草過敏性反應(yīng)減弱。其中重要的致病基因hrcN和hrpE表達(dá)量顯著下調(diào)，證明AAA ATPases相關(guān)基因moxR、ruvB在西瓜噬酸菌的致病力上發(fā)揮重要作用。
　　結(jié)果如下：
　　1．西瓜噬酸菌AAA ATPases相關(guān)基因moxR、ruvB生物信息學(xué)分析
　　登陸NCBI查找西瓜噬酸菌標(biāo)準(zhǔn)菌株AAC00-1的全基因組序列，并找到moxR

5、（Aave_2163）基因和ruvB（Aave_4237）基因。moxR基因大小為921 bp，具有一個(gè)AAA結(jié)構(gòu)域，編碼306個(gè)氨基酸，通過作用于酸酐催化底物的跨膜運(yùn)動(dòng)；ruvB基因大小為1065 bp，具有一個(gè)AAA結(jié)構(gòu)域，能夠編碼354個(gè)氨基酸，具有DNA解旋酶功能，也可通過作用于酸酐催化底物的跨膜運(yùn)動(dòng)。MoxR和RuvB蛋白均不具有跨膜結(jié)構(gòu)域。通過構(gòu)建進(jìn)化樹證明西瓜噬酸菌中MoxR蛋白與青枯菌（Ralstonia solanac

6、earum）的親緣關(guān)系最近，RuvB蛋白與青枯菌（Ralstonia solanacearum）和洋蔥伯克氏菌（Burkholderia cenocepacia）的親緣關(guān)系較近。
　　2．moxR、ruvB基因缺失突變菌株和互補(bǔ)菌株的構(gòu)建及表型測定
　　利用三親本雜交的方法，將自殺性重組質(zhì)粒導(dǎo)入野生型Aac-5中，通過同源重組雙交換獲得基因缺失突變菌株ΔmoxR和ΔruvB。互補(bǔ)菌株通過構(gòu)建互補(bǔ)載體pBBRmoxR、pBBR

7、ruvB，將互補(bǔ)載體導(dǎo)入突變菌株ΔmoxR和ΔruvB中，獲得互補(bǔ)菌株ΔmoxRcomp和ΔruvBcomp。
　　AAA ATPases相關(guān)基因的缺失突變菌株ΔmoxR以及ΔruvB均能引起西瓜噬酸菌致病力降低、運(yùn)動(dòng)能力減弱、生長能力降低、煙草過敏性反應(yīng)減弱、生物膜形成能力增強(qiáng)的表型變化，且互補(bǔ)菌株均能恢復(fù)一定功能。
　　3.基因缺失突變菌株ΔmoxR和ΔruvB相關(guān)基因表達(dá)量測定
　　ΔmoxR基因缺失突變菌株中h