輻射導(dǎo)致長期骨髓抑制的機(jī)制及MnTE骨髓輻射保護(hù)作用的試驗(yàn)觀察.pdf

1、目的:電離輻射(ionizing radiation,IR)不僅引起急性組織損傷,也可導(dǎo)致長期的組織損傷,如長期骨髓抑制(long—term bone marrow depression)。導(dǎo)致長期骨髓抑制的主要原因是IR誘導(dǎo)的造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSCs)衰老。然而,目前不僅IR引起HSCs衰老的分子機(jī)制尚未闡明,而且臨床上也缺乏治療長期骨髓抑制的有效手段。本課題對輻射導(dǎo)致的長期骨髓抑制的機(jī)制

2、進(jìn)行了深入研究,并探討超氧化物歧化酶模擬化合物MnTE對骨髓長期抑制的治療作用,為開發(fā)新的治療長期骨髓抑制的藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:8-10周雄性C57BL/6-Ly-5.2小鼠分為對照組、照射組(亞致死劑量6.5Gy TBI)和照射后給藥組(NADPH氧化酶抑制劑DPI；抗氧化劑MnTE)。給藥2個月后取小鼠骨髓,進(jìn)行以下分析:梯度離心分離小鼠骨髓單個核細(xì)胞(bone marrowmononuclear cells,B

3、M-MNCs),進(jìn)行在體HSCs競爭抑制試驗(yàn)(competitiverepopulation assay)；BM-MNCs在MethoCult M3434 methylcellulose培養(yǎng)基中培養(yǎng),11天后收取單個CFU—GEMM集落進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)分析；流式細(xì)胞儀分選造血干細(xì)胞(hematopoietic progenitor cells,HSCs；或者lin-Sca-1+cKit+,LSK-)、造血祖細(xì)胞(lin-Sca-1-cKi

4、t+,hematopoietic progenitor cells,HPCs)(LSK+),測定兩群細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平;8-羥基-脫氧鳥嘌呤核苷(8-hydroxydeoxyguanine,8-OH-dG)及γ-H2AX免疫熒光染色檢測DNA氧化損傷和DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks,DSBs)；細(xì)胞集落形成試驗(yàn)(Colony-forming cell as

5、say),Cobblestone Area—Forming Cell assay(CAFC)試驗(yàn)和單細(xì)胞CAFC分析檢測兩群細(xì)胞的集落形成能力； Annexin V/PI細(xì)胞染色流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡(apoptosis)；半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)技術(shù)檢測兩群細(xì)胞中NADPH氧化酶(NADPH oxidases,NOX),包括NOX1,NOX2,NOX3和NOX4及P16和p53表達(dá)水平,并對兩群細(xì)胞行NOX3和NOX4

6、免疫熒光染色。
　　 結(jié)果:在輻射導(dǎo)致骨髓損傷的氧化機(jī)制研究中,我們首次發(fā)現(xiàn)小鼠接受亞致死劑量全身照射(6.5Gy TBI)后,其造血祖細(xì)胞(HPCs)內(nèi)ROS短暫性升高,之后迅速下降至正常水平；而HSCs內(nèi)活性氧持續(xù)維持在高水平,即處于長期氧化應(yīng)激狀態(tài)。TBI誘導(dǎo)的HSCs的慢性氧化應(yīng)激與持續(xù)存在的DNA氧化損傷、DNA雙鏈斷裂、HSCs集落形成能力降低及HSCs衰老密切相關(guān),但與細(xì)胞凋亡無關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),TBI所誘導(dǎo)的H

7、SCs長期氧化損傷主要是通過NOX4表達(dá)的上調(diào)介導(dǎo)的,TBI照射引起HSCs NOX4表達(dá)升高,照射后給予diphenylene iodonium(特異性抑制NOXs表達(dá)),抑制了NOXs的活性可明顯降低TBI誘導(dǎo)HSCs內(nèi)活性氧的增加,也可減輕DNA氧化損傷和減少DNA雙鏈斷裂,并明顯提高HSCs的集落形成能力。這些研究結(jié)果首次直接證明輻射可能部分通過上調(diào)NOX4而選擇性提高HSCs慢性氧化應(yīng)激水平,誘導(dǎo)HSCs衰老,最終導(dǎo)致長期骨髓

8、抑制。
　　 為了有效預(yù)防和治療核輻射暴露或接受放射治療患者的長期骨髓抑制,基于TBI誘導(dǎo)HSCs慢性氧化應(yīng)激導(dǎo)致長期骨髓抑制的機(jī)制,我們試圖尋找新的抗氧化劑,治療TBI誘導(dǎo)的長期骨髓抑制。Mn(Ⅲ)meso-tetrakis(N-ethylpyridinium-2-yl)porphyrin(MnTE)是一種超氧化物歧化酶模擬化合物,我們應(yīng)用上述TBI小鼠模型檢測了MnTE對長期骨髓抑制的治療作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),照射后使用MnTE可

9、明顯抑制TBI所致的HSCs、造血祖細(xì)胞活性氧生成和DNA氧化損傷。HSCs內(nèi)氧化應(yīng)激水平下降與骨髓中的HSCs數(shù)量增加和功能改善有關(guān)。照射后使用MnTE治療小鼠的HSCs功能與未照射作為對照小鼠的HSCs的功能已無明顯差異,提示MnTE治療可抑制TBI造成的HSCs功能損傷。照射后使用MnTE治療對輻射造成的HSCs保持休眠或靜止能力及增殖分化能力損傷具有保護(hù)作用,對TBI小鼠HSCs壽命縮短有改善作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),MnTE治療可

10、降低TBI誘導(dǎo)的HSCs中p16 mRNA的表達(dá)水平,提示MnTE治療抑制了TBI誘導(dǎo)的HSCs的衰老,在體內(nèi)競爭性移植試驗(yàn)中,MnTE治療明顯改善照射后小鼠HSCs長期再植能力和多系細(xì)胞造血重建能力。
　　 結(jié)論:輻射誘導(dǎo)造血干細(xì)胞損傷機(jī)制研究發(fā)現(xiàn):TBI選擇性誘導(dǎo)HSCs內(nèi)持續(xù)性ROS升高；HSCs內(nèi)ROS的持續(xù)升高部分是通過NOX4表達(dá)上調(diào)介導(dǎo)；TBI所誘導(dǎo)的HSCs慢性氧化應(yīng)激可通過上調(diào)p16導(dǎo)致HSCs喪失自我更新能力