調(diào)節(jié)性B細(xì)胞與自身免疫性皰病的相關(guān)性研究.pdf

1、自身免疫性皰病(autoimmune bullous diseases,AIBDs)是一組臨床表現(xiàn)為紅斑、糜爛、水皰、大皰的自身免疫性疾病,病情多頑固且易反復(fù)發(fā)作[1,2]。目前認(rèn)為該類疾病的發(fā)病主要是由致病性抗體與抗原結(jié)合并激活一系列的免疫炎癥反應(yīng)導(dǎo)致表皮間或者真皮基底膜帶的不同粘附分子被破壞而致病。大皰性類天皰瘡(bullous pemphigoid,BP)和尋常型天皰瘡(pemphigus vulgaris,PV)是最為常見的靶抗

2、原明確的自身免疫性皰病[3-5]。PV中自身反應(yīng)性B細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞識別的主要靶抗原為橋粒芯糖蛋白1(Dsg1)和橋粒芯糖蛋白3(Dsg3),BP中主要靶抗原為大皰性類天皰瘡抗原1和抗原2,即BPAG1(BP230)和BPAG2(BP180),目前認(rèn)為BP180是BP主要的致病性抗原,其胞外端的第16位非膠原編碼區(qū)(NC16A)區(qū)域是主要的致病性靶表位區(qū)[6-9]。
　　近年來的研究證實(shí)致病性自身抗體的產(chǎn)生是自身免疫性皰病的關(guān)

3、鍵致病因素[10]。但是自身抗體是如何產(chǎn)生的,以及免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞如調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(regulatory B cells,Breg)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)以及體液免疫中輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的濾泡輔助性T細(xì)胞(follicular helper T cells,Tfh)在自身免疫性皰病發(fā)病中的作用目前均不清楚。
　　B細(xì)胞是否像T細(xì)胞一樣存在多種不同調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞亞群是目前免疫學(xué)研究的熱點(diǎn),并于近年

4、取得了很多重要的研究發(fā)現(xiàn)。目前已經(jīng)明確并得到公認(rèn)在小鼠體內(nèi)存在一群主要通過分泌白介素10(IL-10)而發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用的為數(shù)較少的Breg亞群,其表面標(biāo)記為CD19+CD5+CD1dhi,并且在多種疾病包括I型糖尿病、接觸性超敏反應(yīng)、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎等動物模型中證實(shí)了其對免疫炎癥反應(yīng)的抑制作用[11-13]。2011年美國杜克大學(xué)的一個研究小組證實(shí)了類似小鼠調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的人調(diào)節(jié)性B細(xì)胞亞群的存在,其主要的表面標(biāo)記為CD19+CD2

5、4hiCD27+,并發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞亞群與多種自身免疫性疾病有著密切的聯(lián)系[14]。Breg細(xì)胞與自身免疫性皰病的關(guān)系如何?Breg細(xì)胞對致病性自身抗體的產(chǎn)生有什么樣的影響?本課題通過檢測尋常型天皰瘡和大皰性類天皰瘡患者外周血中Breg細(xì)胞水平,研究Breg細(xì)胞與AIBDs發(fā)病的相關(guān)性,通過觀察Breg細(xì)胞對大皰性類天皰瘡抗體產(chǎn)生的影響,初步探討B(tài)reg細(xì)胞參與AIBDs發(fā)病過程中抗體產(chǎn)生的機(jī)制,從而深化對AIBDs發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識,為其治療提

6、供新的思路。
　　目的:明確Breg細(xì)胞與PV和BP兩種疾病的相關(guān)性,確定BP患者外周血Breg細(xì)胞的負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能,觀察Breg細(xì)胞對大皰性類天皰瘡致病性自身抗體產(chǎn)生的影響,探討其在AIBDs發(fā)病中的重要作用。
　　方法:
　　1)收集PV和BP患者及健康對照者外周血,分離提取獲得相應(yīng)的血清、PBMC以及RNA;
　　2)利用流式細(xì)胞術(shù)觀察患者PBMC中Breg細(xì)胞水平的變化;
　　3)利用Realti

7、me-PCR和Elisa方法分析患者及健康對照者的外周血中IL-10的表達(dá)水平;
　　4)利用磁珠分選及流式細(xì)胞術(shù)分選健康人以及BP患者外周血的Breg細(xì)胞(CD19+CD24hiCD27+)和效應(yīng)T細(xì)胞(CD4+CD25-);通過構(gòu)建細(xì)胞共孵育模型,研究Breg細(xì)胞對效應(yīng)T細(xì)胞的負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能;
　　5)原核表達(dá)BP自身抗原BP180-NC16A,以該抗原刺激BP患者PBMC,通過檢測培養(yǎng)上清中致病性抗體水平的變化,比較

8、Breg細(xì)胞是否影響致病性抗體的產(chǎn)生。
　　結(jié)果:自身免疫性皰病PV、BP患者外周血中Breg細(xì)胞水平明顯高于健康對照組?；颊咄庵苎蠭L-10在蛋白水平及RNA水平與健康對照組相比沒有顯著差異。健康人外周血中Breg細(xì)胞能夠明顯抑制CD4+T細(xì)胞IFN-γ、TNF-α以及IL-4的產(chǎn)生和CD4+T細(xì)胞的增殖,而來自BP患者的Breg細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞IFN-γ、TNF-α、IL-4的產(chǎn)生以及CD4+T細(xì)胞增殖的抑制作用存在缺陷

9、。來自BP患者的B細(xì)胞對BP180-NC16A抗原具有抗原特異性反應(yīng),其分泌的致病性抗體水平明顯升高;而清除Breg細(xì)胞亞群(CD19+CD24hiCD27+)后進(jìn)行BP180-NC16A抗原刺激培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)在無Breg細(xì)胞情況下抗體產(chǎn)生水平未受明顯影響。
　　結(jié)論:BP和PV患者外周血中Breg細(xì)胞數(shù)量增多,提示Breg細(xì)胞可能與自身免疫性皰病的發(fā)病有相關(guān)性。BP患者Breg細(xì)胞負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能存在缺陷,而且Breg細(xì)胞不能有效抑