調(diào)節(jié)性B細胞與自身免疫性皰病的相關性研究.pdf

1、自身免疫性皰病(autoimmune bullous diseases,AIBDs)是一組臨床表現(xiàn)為紅斑、糜爛、水皰、大皰的自身免疫性疾病,病情多頑固且易反復發(fā)作[1,2]。目前認為該類疾病的發(fā)病主要是由致病性抗體與抗原結合并激活一系列的免疫炎癥反應導致表皮間或者真皮基底膜帶的不同粘附分子被破壞而致病。大皰性類天皰瘡(bullous pemphigoid,BP)和尋常型天皰瘡(pemphigus vulgaris,PV)是最為常見的靶抗

2、原明確的自身免疫性皰病[3-5]。PV中自身反應性B細胞和CD4+T細胞識別的主要靶抗原為橋粒芯糖蛋白1(Dsg1)和橋粒芯糖蛋白3(Dsg3),BP中主要靶抗原為大皰性類天皰瘡抗原1和抗原2,即BPAG1(BP230)和BPAG2(BP180),目前認為BP180是BP主要的致病性抗原,其胞外端的第16位非膠原編碼區(qū)(NC16A)區(qū)域是主要的致病性靶表位區(qū)[6-9]。
　　近年來的研究證實致病性自身抗體的產(chǎn)生是自身免疫性皰病的關

3、鍵致病因素[10]。但是自身抗體是如何產(chǎn)生的,以及免疫調(diào)節(jié)細胞如調(diào)節(jié)性B細胞(regulatory B cells,Breg)、調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)以及體液免疫中輔助B細胞產(chǎn)生抗體的濾泡輔助性T細胞(follicular helper T cells,Tfh)在自身免疫性皰病發(fā)病中的作用目前均不清楚。
　　B細胞是否像T細胞一樣存在多種不同調(diào)節(jié)功能的細胞亞群是目前免疫學研究的熱點,并于近年

4、取得了很多重要的研究發(fā)現(xiàn)。目前已經(jīng)明確并得到公認在小鼠體內(nèi)存在一群主要通過分泌白介素10(IL-10)而發(fā)揮負向免疫調(diào)節(jié)作用的為數(shù)較少的Breg亞群,其表面標記為CD19+CD5+CD1dhi,并且在多種疾病包括I型糖尿病、接觸性超敏反應、膠原誘導的關節(jié)炎等動物模型中證實了其對免疫炎癥反應的抑制作用[11-13]。2011年美國杜克大學的一個研究小組證實了類似小鼠調(diào)節(jié)性B細胞的人調(diào)節(jié)性B細胞亞群的存在,其主要的表面標記為CD19+CD2

5、4hiCD27+,并發(fā)現(xiàn)該細胞亞群與多種自身免疫性疾病有著密切的聯(lián)系[14]。Breg細胞與自身免疫性皰病的關系如何?Breg細胞對致病性自身抗體的產(chǎn)生有什么樣的影響?本課題通過檢測尋常型天皰瘡和大皰性類天皰瘡患者外周血中Breg細胞水平,研究Breg細胞與AIBDs發(fā)病的相關性,通過觀察Breg細胞對大皰性類天皰瘡抗體產(chǎn)生的影響,初步探討B(tài)reg細胞參與AIBDs發(fā)病過程中抗體產(chǎn)生的機制,從而深化對AIBDs發(fā)病機理的認識,為其治療提

6、供新的思路。
　　目的:明確Breg細胞與PV和BP兩種疾病的相關性,確定BP患者外周血Breg細胞的負向免疫調(diào)節(jié)功能,觀察Breg細胞對大皰性類天皰瘡致病性自身抗體產(chǎn)生的影響,探討其在AIBDs發(fā)病中的重要作用。
　　方法:
　　1)收集PV和BP患者及健康對照者外周血,分離提取獲得相應的血清、PBMC以及RNA;
　　2)利用流式細胞術觀察患者PBMC中Breg細胞水平的變化;
　　3)利用Realti

7、me-PCR和Elisa方法分析患者及健康對照者的外周血中IL-10的表達水平;
　　4)利用磁珠分選及流式細胞術分選健康人以及BP患者外周血的Breg細胞(CD19+CD24hiCD27+)和效應T細胞(CD4+CD25-);通過構建細胞共孵育模型,研究Breg細胞對效應T細胞的負向免疫調(diào)節(jié)功能;
　　5)原核表達BP自身抗原BP180-NC16A,以該抗原刺激BP患者PBMC,通過檢測培養(yǎng)上清中致病性抗體水平的變化,比較

8、Breg細胞是否影響致病性抗體的產(chǎn)生。
　　結果:自身免疫性皰病PV、BP患者外周血中Breg細胞水平明顯高于健康對照組?；颊咄庵苎蠭L-10在蛋白水平及RNA水平與健康對照組相比沒有顯著差異。健康人外周血中Breg細胞能夠明顯抑制CD4+T細胞IFN-γ、TNF-α以及IL-4的產(chǎn)生和CD4+T細胞的增殖,而來自BP患者的Breg細胞對CD4+T細胞IFN-γ、TNF-α、IL-4的產(chǎn)生以及CD4+T細胞增殖的抑制作用存在缺陷

9、。來自BP患者的B細胞對BP180-NC16A抗原具有抗原特異性反應,其分泌的致病性抗體水平明顯升高;而清除Breg細胞亞群(CD19+CD24hiCD27+)后進行BP180-NC16A抗原刺激培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)在無Breg細胞情況下抗體產(chǎn)生水平未受明顯影響。
　　結論:BP和PV患者外周血中Breg細胞數(shù)量增多,提示Breg細胞可能與自身免疫性皰病的發(fā)病有相關性。BP患者Breg細胞負向免疫調(diào)節(jié)功能存在缺陷,而且Breg細胞不能有效抑